Полиплоидия. Основы косметологии: что мы знаем о фибробластах Показания к процедуре

Основное направление деятельности современной эстетической медицины - предотвращение старения при помощи высоких технологий. В результате научных исследований выявлена закономерность, заключающаяся в том, что клетки имеют способность возрождаться. Обладают этими свойствами и фибробласты, регенерация которых приводит к омоложению кожных покровов и устранению видимых дефектов на них.

Функции и природа фибробластов

Термин «фибробласты» состоит из двух латинских слов, переводимых буквально как «росток» и «волокно». По своей природе они представляют клетки соединительной ткани, синтезирующие внеклеточный матрикс (структуру ткани, которая обеспечивает перенесение химических веществ и механическую поддержку клеток кожи). Фибробласты вырабатывают вещества, которые являются предшественникам коллагеновых и эластиновых волокон, гиалуроновую кислоту, фибрин.

Происходят они из мезенхимы - зародышевой ткани, которая есть в клетках организма людей и животных. В активном состоянии структура фибропластов подразумевает наличие ядра и отростков, они имеют увеличенный размер и содержат большое количество рибосом, в состоянии покоя они уменьшаются и приобретают веретенообразную форму.

Фибробласты кожи обладают широким спектром функций. Благодаря их наличию в организме происходят следующие процессы:

Активизация процессов синтеза коллагена и эластина.
Формирование сосудов.
Направление клеток иммунной системы к бактериям и чужеродным частицам.
Ускорение разрастания тканей.
Усиление роста клеток.
Заживление поврежденных участков кожи.
Выработка ряда белков (протеогликан, ламинин и другие).

Причины возрастных изменений

Молодость кожи определяется цикличным процессом выработки коллагена и эластина, которые впоследствии расщепляются на составные части, используемые фиброластами для их повторной выработки. Со временем последние снижают свою активность, переставая производить коллагеновые и эластиновые волокна, что в конечном итоге провоцирует старение кожи.

Возрастные изменения начинают проявляться уже с 28 — 30 лет. Они выражаются в потере упругости и развитии птоза, изменении цвета кожи, повышении сухости, образовании морщин. И все это в связи с тем, что каждое десятилетие фибробласты уменьшаются на 10 % от первоначального числа.

Восполнение количества фибробластов

Итак, для того чтобы замедлить старение и вернуть молодость необходимо восстановить фибробласты . Большинство современных косметологических методик приводит лишь к временному ускорению синтеза коллагеновых волокон, но не увеличивают сами клетки. Долгое время было принято считать, что это попросту невозможно.

В настоящее время наука шагнула далеко вперед, и восстановление фибробластов это уже не фантастика. Данная процедура получила название SPRS-терапия и широко практикуется в Штатах, европейских странах и с недавнего времени на территории России.

SPRS-терапия: особенности и принцип проведения

Восстановить фибробласты непросто, для этого требуется пройти через сложнейшую инъекционную процедуру. Результатами ее проведения являются утолщение кожи и повышение уровня ее эластичности, профилактика и снижение птоза. Также уменьшаются морщины, исчезает пигментация и разглаживаются рубцы.

Начинается терапия с забора клеток пациента с кожи, расположенной за ушной раковиной. Полученный образец используется для диагностики и изучения, именуется биоматериалом. Он применяется для разработки схемы лечения и искусственного воссоздания фибробластов, которые впоследствии при помощи уколов будут введены обратно в кожу.

Клетки, выращенные на основе биоматериалов пациента, не отторгаются организмом. После трансплантации они сохраняют свою активность в течение полутора лет, на протяжении которых состояние кожи улучшается.

Фибробласты не рекомендуется внедрять посредством инъекций во время обострения хронических заболеваний, при простуде, вирусных инфекциях, сопровождающихся повышенной температурой тела. Среди противопоказаний числится иммунодефицит, злокачественные образования, инфекции и хронические заболевания в острой стадии. Перед проведением процедуры обязательна предварительная консультация со специалистом для выявления индивидуальных противопоказаний.

Процедура занимает не более часа и проводится курсом из 2 сеансов с перерывом от 5 до 7 недель. Перед инъекциями обязательно проведение местной анестезии.

Внедрить фибробласты - удовольствие дорогостоящее. Полный спектр услуг, включающий забор, хранение, исследование и введение биоматериалов оценивается примерно в 400 000 рублей.

Видео: проведение SPRS терапии

Фибробласты - клетки соединительной ткани, обеспечивающие выработку коллагена и эластина, следовательно, поддерживающие молодость нашей кожи. Со временем их количество в организме неуклонно снижается, за счет чего и проявляются внешние признаки возрастных изменений. Восстановление числа фибробластов проводится посредством инъекционной методики на основе искусственно выращенных клеток.

Основными клетками соединительной ткани являются фибробласты (семейство фибриллообразующих клеток), макрофаги, тучные клетки, адвентициальные клетки, плазматические клетки, перициты, жировые клетки, а также лейкоциты, мигрирующие из крови; иногда встречаются пигментные клетки.

Фибробласты (фибробластоциты) (от лат. fibra - волокно, греч. blastos - росток, зачаток) - клетки, синтезирующие компоненты межклеточного вещества: белки (например, коллаген, эластин), протеогликаны, гликопротеины. В эмбриональном периоде ряд мезенхимных клеток зародыша дают начало дифферону фибробластов, к которому относят: стволовые клетки, полустволовые клетки-предшественники, малоспециализированные фибробласты, дифференцированные фибробласты (зрелые, активно функционирующие), фиброциты (дефинитивные формы клеток), миофибробласты и фиброкласты. С главной функцией фибробластов связаны образование основного вещества и волокон (что ярко проявляется, например, при заживлении ран, развитии рубцовой ткани, образовании соединительнотканной капсулы вокруг инородного тела).

Фибробласты – это подвижные клетки. В их цитоплазме, особенно в периферическом слое, располагаются микрофиламенты, содержащие белки типа актина и миозина. Движение фибробластов становится возможным только после их связывания с опорными фибриллярными структурами с помощью фибронектина - гликопротеина, синтезируемого фибробластами и другими клетками, обеспечивающего адгезию клеток и неклеточных структур. Во время движения фибробласт уплощается, а его поверхность может увеличиться в 10 раз. По способности синтезировать фибриллярные белки к семейству фибробластов можно отнести ретикулярные клетки ретикулярной соединительной ткани кроветворных органов, а также хондробласты и остеобласты скелетной разновидности соединительной ткани.

Фиброциты - дефинитивные (конечные) формы развития фибробластов. Эти клетки веретенообразные с крыловидными отростками. Они содержат небольшое число органелл, вакуолей, липидов и гликогена. Синтез коллагена и других веществ в фиброцитах резко снижен.

Миофибробласты - клетки, сходные с фибробластами, сочетающие в себе способность к синтезу не только коллагеновых, но и сократительных белков в значительном количестве. Фибробласты могут превращаться в миофибробласты, функционально сходные с гладкими мышечными клетками, но в отличие от последних имеют хорошо развитую эндоплазматическую сеть. Такие клетки наблюдаются в грануляционной ткани заживающих ран и в матке при развитии беременности.

Фиброкласты - клетки с высокой фагоцитарной и гидролитической активностью, принимают участие в «рассасывании» межклеточного вещества в период инволюции органов (например, в матке после окончания беременности). Они сочетают в себе структурные признаки фибриллообразующих клеток (развитую гранулярную эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, относительно крупные, но немногочисленные митохондрии), а также лизосомы с характерными для них, гидролитическими ферментами. Выделяемый ими за пределы клетки комплекс ферментов расщепляет цементирующую субстанцию коллагеновых волокон, после чего происходят фагоцитоз и внутриклеточное переваривание коллагена. Следующие клетки волокнистой соединительной ткани уже не относятся к дифферону фибробластов.

Макрофаги (или макрофагоциты) (от греч. makros - большой, длинный, fagos - пожирающий) - это гетерогенная специализированная клеточная популяция защитной системы организма.

Формы проявления защитной функции макрофагов:

1. поглощение и дальнейшее расщепление или изоляция чужеродного материала;

2. обезвреживание его при непосредственном контакте;

3. передача информации о чужеродном материале иммунокомпетентным клеткам, способным его нейтрализовать;

4. оказание стимулирующего воздействия на другие клеточные популяции защитной системы организма.

Макрофаги имеют органеллы, синтезирующие ферменты для внутриклеточного и внеклеточного расщепления чужеродного материала, антибактериальные и другие биологически активные вещества (например: протеазы, кислые гидролазы, пироген, интерферон, лизоцим и др.).

Тучные клетки (или тканевые базофилы, или же лаброциты). В их цитоплазме находится специфическая зернистость, напоминающая гранулы базофильных лейкоцитов крови. Тучные клетки являются регуляторами местного гомеостаза соединительной ткани. Они принимают участие в понижении свертываемости крови, повышении проницаемости гематотканевого барьера, в процессах воспаления и иммуногенеза. У человека тучные клетки обнаруживаются всюду, где имеются прослойки рыхлой волокнистой соединительной ткани. Особенно много тканевых базофилов в стенке органов желудочно-кишечного тракта, матке, молочной железе, тимусе, миндалинах. Они часто располагаются группами по ходу кровеносных сосудов микроциркулярного русла - капилляров, артериол, венул и мелких лимфатических сосудов.

Плазматические клетки (или плазмоциты). Эти клетки обеспечивают выработку антител - гамма-глобулинов при появлении в организме антигена. Они образуются в лимфоидных органах из B-лимфоцитов, обычно встречаются в рыхлой волокнистой соединительной ткани собственного слоя слизистых оболочек полых органов, сальнике. Адипоциты (или жировые клетки). Так называют клетки, которые обладают способностью накапливать в больших количествах резервный жир, принимающий участие в трофике, энергообразовании и метаболизме воды. Адипоциты располагаются группами, реже поодиночке и, как правило, около кровеносных сосудов. Накапливаясь в больших количествах, эти клетки образуют жировую ткань – разновидность соединительной ткани со специальными войствами.

Адвентициальные клетки. Это малоспециализированные клетки, сопровождающие кровеносные сосуды. Они имеют уплощенную или веретенообразную форму со слабобазофильной цитоплазмой, овальным ядром и небольшим числом органелл. В процессе дифференцировки эти клетки могут, по-видимому, превращаться, в фибробласты, миофибробласты и адипоциты. Перициты - (или клетки Руже) клетки, окружающие кровеносные капилляры и входящие в состав их стенки.

Пигментные клетки (пигментоциты, меланоциты). Эти клетки содержат в своей цитоплазме пигмент меланин. Их много в родимых пятнах, а также в соединительной ткани людей черной и желтой рас. Пигментоциты имеют короткие, непостоянной формы отростки, большое количество меланосом (содержащих гранулы меланина) и рибосом.

Межклеточное вещество, или внеклеточный матрикс (substantia intercellularis), соединительной ткани состоит из коллагеновых и эластических волокон, а также из основного (аморфного) вещества. Межклеточное вещество как у зародышей, так и у взрослых образуется, с одной стороны, путем секреции соединительнотканными клетками, а с другой - из плазмы крови, поступающей в межклеточные пространства.

Коллагеновые структуры, входящие в состав соединительных тканей организмов человека и животных, являются наиболее представительными ее компонентами, образующими сложную организационную иерархию. Основу всей группы коллагеновых структур составляет волокнистый белок - коллаген, который определяет свойства коллагеновых структр. Эластические волокна Наличие эластических волокон в соединительной ткани определяет ее эластичность и растяжимость. По прочности эластические волокна уступают коллагеновым. Форма поперечного разреза волокон округлая и уплощенная. В рыхлой волокнистой соединительной ткани эластические волокна широко анастомозируют друг с другом.

Владельцы патента RU 2536992:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа с получением банка рабочих клеток 16 пассажа. При этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Изобретение позволяет повысить пролиферативную активность диплоидных клеток фибробластов человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, медицине, в частности к способу повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для использования таких клеток в лечебных и диагностических целях, в том числе для определения антивирусной активности интерферонов человека, для заместительной клеточной терапии.

Линии диплоидных клеток человека (ЛДКЧ) обладают неоспоримыми преимуществами перед всеми известными видами клеточных культур своей способностью сохранять в пассажах стабильные биологические и генетические характеристики. Аттестацию ЛДКЧ, предназначенных для производства вакцин, проводят в соответствии с едиными требованиями, разработанными Всемирной организацией здравоохранения . Эти рекомендации взяты за основу национальных критериев аттестации вакцинных ЛДКЧ, разработанных ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича и МЗ СССР [Методические рекомендации «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» РД-42-28-10-89. МЗ СССР. М., 1989. - С. 16]. Аттестованная линия диплоидных клеток человека имеет ограниченный срок жизни и обладает стабильными биологическими, культуральными и генетическими характеристиками, она свободна от контаминантов (бактерий, грибов, микоплазм, вирусов) и не вызывает образования опухолей у иммуносупрессированных животных. Линия диплоидных клеток должна иметь аттестованный банк посевных клеток на ранних уровнях пассажей (до 10 пассажа), состоящий не менее чем из 200 криопробирок. При пассировании посевных клеток из одной или нескольких криопробирок до уровня 16 пассажа получают рабочий банк клеток, из которого могут быть получены необходимые культуры-продуценты для производства или для исследовательской работы. В России и за рубежом существуют всего несколько линий диплоидных клеток человека (Wi-38, MRC-5, М-22 и др.), аттестованных согласно перечисленным требованиям. Аттестованные ЛДКЧ используют при изгототовлении вакцин против полиомиелита, кори, краснухи, бешенства, респираторной и цитомегаловирусной инфекций, а также интерферона [Т.К. Борисова, Л.Л. Миронова, О.И. Конюшко, В.Д. Попова, В.П. Грачев, Н.Р. Шухмина, В.В. Зверев. Отечественные штаммы диплоидных клеток человека - субстрат для производства вакцин. Медицинская вирусология. Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии, посвященной 100-летию М.П. Чумакова». М. 2009. Том XXVI. С. 305-307; Л.Л. Миронова, В.Д. Попова, О.И. Конюшко. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. Биотехнология. 2000, с. 41-47]. ЛДКЧ широко применяются in vitro для диагностики вирусных инфекций, анализа токсичности различных препаратов и изделий, для заместительной терапии [Патент РФ №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова; С.В. Смирнов, В.Б. Хватов. Инновационные технологии местного лечения ожогов в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В книге: Новая экономика. Инновационный портрет России. М., Центр стратегического партнерства, 2009. С. 388-390].

В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 80-х годах 20 века было установлено несколько линий диплоидных клеток из кожи и мышц 8-10 недельных эмбрионов человека. Настоящая работа посвящена модификации производства диплоидных клеток человека для диагностических целей и заместительной клеточной терапии, а именно получению диплоидных клеток фибробластов человека с повышенными пролиферативными свойствами.

Прототип. Патент РФ №1440029 от 22.03.93 г. [Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Соловьева М.Н., Орлова Т.Г. Стобецкий В.И., Крючкова Г.П., Кармышева В.Я., Кудинова С.И., Попова В.Д., Алпатова Г.А. ИПВЭ и НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов].

Этот штамм ЛДКЧ обозначен М-21, однако культура фибробластов М-21 обладала недостаточной пролиферативной активностью, что снижало время образования монослоя и повышало расход клеток и материалов, и это, в конечном итоге, привело к полному истощению ее запасов. В результате возникла необходимость в новой клеточной линии, пригодной для определения антивирусной активности интерферонов человека и других медико-биологических целей, более экономически выгодной, отличающейся высокой пролиферативной активностью, имеющей банки посевных и рабочих клеток. Эта линия обозначена М-20. На уровне 7 пассажа изготовлен банк посевных клеток. В 2012 году из ампулы банка 7 пассажа изготовлен банк рабочих клеток на уровне 16 пассажа. Банки посевных и рабочих клеток на уровнях 7 и 16 пассажей хранятся в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН и позволяют обеспечить как производственные процессы, так и научные исследования.

Отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога (прототипа) является повышение пролиферативной активности клеток линии М-20 при использовании 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП).

Таким образом, объектом изобретения является способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для медико-биологических целей посредством культивирования клеток из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, в котором используют диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20, которые масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека. При культивировании клеток используют, предпочтительно, питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.

Диплоидные клетки человека охарактеризованной линии М-20, получаемые вышеуказанным способом, обладают высокой пролиферативной активностью и пригодны для использования в лечебных и/или диагностических целях.

Схема осуществления способа:

1. Используется одна криопробирка из банка посевных клеток 7 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

2. Приготовление банка рабочих клеток на уровне 16 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

3. Восстановление фибробластов линии М-20 из банка рабочих клеток 16 пассажа (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

4. Получение монослойной культуры фибробластов линии М-20, 17 пассаж.

5. Восстановление биологических свойств фибробластов линии М-20 путем трехкратного пассирования (до 20 пассажа включительно) для репарации возможных повреждений ДНК в процессе криоконсервирования.

6. Получение культур клеток для диагностических целей и заместительной клеточной терапии тиражированием фибробластов линии М-20 с 20 по 33 пассаж с использованием питательной среды, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл).

Предлагаемый способ обеспечивает получение клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и пригодных для использования в диагностических и/или лечебных целях.

Данный технический результат достигается культивированием фибробластов человека линии М-20 в питательной среде с добавлением 10 % фибринолитически активной плазмы (ФАП), обладающей ростстимулирующим действием и обеспечивающей усиление пролиферативной активности культуры клеток.

ФАП - клинически используемая трансфузионная среда, которую получают из крови внезапно умерших от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности, кровоизлияния в головной мозг, в первые 6 часов после смерти [приказ МЗ СССР №482 от 14.06.1972 года «Об улучшении обеспечения лечебно-профилактических учреждений и клиник трупными тканями, костным мозгом и кровью»]. Посмертная кровь является полноценной трансфузионной средой, имеющей ряд биологических свойств - в первую очередь повышенный фибринолитический потенциал. В этой связи посмертную кровь предложено также называть фибринолизной. Основные показания к переливанию посмертной крови: острая кровопотеря, шок, анемия различного происхождения, ожоговая травма, обменное замещение при экзогенных отравлениях, заполнение АИКа при использовании экстракорпорального кровоообращения в хирургии [Е.Г. Цуринова. Переливание фибринолизной крови. М., 1960, 159 с; С.В. Рыжков. Заготовка и возможности использования фибринолизной крови в зависимости от срока взятия и причины смерти. Автореф. докт. дисс. Л., 1968, 21 с.; Г.А. Пафомов. Биологическая характеристика крови внезапно умерших и ее использование в хирургической практике. Дисс. докт. мед. Наук. М., 1971, 355 с.; К.С. Симонян, К.П. Гутионтова, Е.Г. Цуринова. Посмертная кровь в аспекте трансфузиологии. М., Медицина, 1975, 271 с.]. В настоящее время используются компоненты посмертной крови: фибринолитически активная плазма, эритроцитная масса, лейкоцитная масса, тромбоцитная масса [Г.Я. Левин. Гемокоагуляционные свойства и клиническое применение плазмы и тромбоцитов кадаверной крови. Автореф. докт. дисс. М., 1978, 31 с; В.Б. Хватов. Препараты фибринолитического и антипротеназного действия из плазмы крови внезапно умерших людей. Дисс. докт. мед наук, 1984, 417 с.; V.B. Khvatov Plasmakinase - a new thrombolytic preparation from postmortem plasma In: Thrombosis and Thrombolysis edd. E.I. Chazov, V.V. Smirnov). Consultants Bureau, N.Y., L, 1986, p. 283-310; В.Б. Хватов. Медико-биологические аспекты использования посмертной крови. Вестник АМН СССР, 1991, 9. С. 18-24; В.Б. Хватов. Трупная кровь - история и современное состояние вопроса. Пробл. гематол. и перелив. крови, 1997, 1. С. 51-59]. Компоненты трупной крови, получаемые от доноров органов, также получили клиническое применение [погибший индивидуум с бьющимся сердцем согласно “Инструкции по констатации смерти человека на основании диагноза смерти мозга» от 20.12.2001 г. №460, регистрация Минюста №3170 от 17 января 2002]. Трансплантация органов, тканей и клеток осуществляется согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» - в ред. Федеральных законов от 20.06.2000 №91-Ф3, от 16.10.2006 №160-Ф3; В.Б. Хватов, С.В. Журавель, В.А. Гуляев, Е.Н. Кобзева, М.С. Макаров. Биологическая полноценность и функциональная активность клеточных компонентов крови доноров органов. Трансплантология, 2011, 4, с. 13-19; Хубутия М.Ш., Хватов В.Б., Гуляев В.А. и др. Способ компенсации глобулярного объема крови и иммуномодулирующего воздействия при трансплантации. Патент РФ на изобретение №2452519, опубл. 10.06.2012, бюл. №16].

Фибринолитически активную плазму получают из крови внезапно умерших людей, заготовленной на консерванте Глюгицир (соотношение кровь: консервант 4:1) для сохранения ее фибринолитически активных свойств. Отделение плазмы от клеточных элементов крови производят в стерильном боксе с соблюдением всех правил асептики и антисептики и аналогично получению донорской плазмы из консервированной донорской крови. Клиническое использование ФАП в хирургии и травматологии выявило эффект стимуляции заживления ран [И.Ю. Клюквин, М.В. Звездина, В.Б. Хватов, Ф.А. Бурдыга. Способ лечения укушенных ран. Патент на изобретение РФ №2372927, опубл., 20.11.2009, бюлл. №32]. Этот эффект мы связывали с присутствием ростстимулирующих факторов в ФАП, выделяемых активированными тромбоцитами. В дальнейшем в ФАП нами идентифицирован тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Ростстимулирующее действие ФАП в культуре клеток человека показано в специальных исследованиях. В клеточную суспензию фибробластов человека линии М-20, содержащую известное количество клеток, добавляли исследуемые образцы ФАП в 10% концентрации и по 10 мл полученной смеси помещали в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 25 см 2 . Клетки выращивали в течение 3-4 суток при содержании в атмосфере 5% CO 2 и при 37°C. После 3-кратного пассирования проводили подсчет выросших клеток в камере Фукс-Розенталя и определяли отношение числа выросших клеток к числу посаженных - индекс пролиферации (в таблице 1).

Из проведенных опытов следует, что ростовые свойства ФАП обеспечивают высокую пролиферативную активность и не отличаются от таковой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. При этом ФАП содержит ростовые факторы тромбоцитов человека, т.е. аллогенного типа, в отличие от эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - ксеногенного типа. Этот факт является определяющим при трансплантации клеток при заместительной терапии. Отметим, что ростстимулирующее действие на культуру клеток линии М-20 обусловлено, в частности, наличием в ФАП PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Эти данные получены с помощью набора реагентов «Qantikine, Human PDGF-BB Immunoassay» фирмы «R & D Systems» и системы «Multiskan ascent» фирмы «Thermo». Концентрация PDGF-BB в ФАП сходна с его содержанием в сыворотке крови. Так в сыворотке доноров крови и обследованных пациентов содержание PDGF составило от 110 до 880 пг/л, в среднем 244 пг/мл, тогда как в плазме содержание PDGF варьировало от 0-2 пг/мл.

Для лучшего понимания предлагаемого технического решения «производство диплоидных клеток человека линии М-20 для медико-биологических целей» приводим следующий пример.

Клетки линии М-20 16 пассажа восстанавливают из рабочего банка. Для этого криопробирку с клетками извлекают из жидкого азота и помещают в водяную баню при температуре 38°C и после оттаивания содержимое переносят в культуральный сосуд с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% ФАП (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл), добавляют антибиотик гентамицин из расчета 1 мл 4% раствора на 1 л питательной среды. Для формирования монослоя клетки культивируют в течение 4-5 суток при 37°C и содержании CO 2 в атмосфере 5%. После формирования монослоя клеток проводят 3 последовательных пассажа, необходимых для репарации ДНК после криоконсервирования. Затем проводят тиражирование клеток с 20 по 33 пассаж. Клетки этих пассажей предназначены для медико-биологических целей. Полученная линия клеток подробно охарактеризована в соответствии с требованиями ВОЗ и ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича, включая HLA-типирование клеток линии М-20, а также проведено изучение ее цитокинового спектра. Приводим сравнительную характеристику свойств линии М-20 и линии М-22 (таблица 2). Линия М 22 (диплоидные фибробласты человека) лицензирована в качестве вакцинного субстрата и разрешена для производства любых видов медицинских вирусных вакцин, а также применена для лечения ожоговых ран II-IIIA степени [Патент РФ на изобретение №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова, О.И. Клнюшко, Е.А. Жиркова, B.C. Бочарова].

Линия М-20 установлена в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 1986 году из кожи и мышц 10-недельного эмбриона человека, полученного в результате аборта от здоровой женщины. Онкологических, венерических заболеваний, гепатита, туберкулеза в анамнезе не обнаружено; генетических и врожденных заболеваний в семье не наблюдалось. Среда культивирования клеток ДМЕМ с добавлением 10% ФАП. Коэффициент рассева 1:3-1:4 дважды в неделю при посевной дозе клеток 7×10 4 кл/мл. Клеточный монослой состоит из ориентированных однородных веретеновидных клеток с овальными ядрами, содержащими 1-3 ядрышка и мелкие глыбки хроматина. В жизненном цикле линии можно выделить 3 фазы развития: становление 1-3 пассажи, активный рост 4-40 и старение 41-52, затем наступала гибель. Клетки линии имеют кариотип человека 2т=46, ХУ. Линия характеризуется высокой генетической стабильностью: 93,3-96,9% клеток имеют диплоидный набор хромосом, клеток с полиплоидным набором не более 1,6%. Пробелов и разрывов, а также кольцевых хромосом не наблюдали. Количество полос изоэнзимов Г-6ФДЕ и ЛДЕ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа. При посеве на селективные питательные среды контаминации бактериями, грибами, микоплазмами не обнаружено. Кроме этого контаминации микоплазмами не выявлено при окраске ДНК-флуорохромами Hochst 33258 и оливомицином, а также методом ПЦР. Контаминации вирусами в опытах на сосунках и взрослых белых мышах, морских свинках, кроликах и куриных эмбрионах, а также на гомологичных и гетерологичных культурах клеток не обнаружено. Контроль туморогенности. При введении клеток линии иммунодепрессированным животным опухоли не образовывались. Обратной транскриптазы не обнаружено. HLA-маркеры: Класс I: A*(02.03)/B*(07.40)/CW*(03.07). Класс II: DRB1*(15.16)/DQB1*(05.06). Клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК α-интерферона (ИФНα) и интерлейкинов: ИЛ1β, 2, 4, 6, 8, 10, 18.

Таким образом, предлагаемая линия является диплоидной - обладает ограниченным сроком жизни, сохраняет кариотип нормальных клеток человека на протяжении всей жизни, свободна от контаминантов и не обладает онкогенными потенциями. Она охарактеризована на безопасность в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича. В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН имеются банки посевных и рабочих клеток, способные обеспечить все потребности производства и научных исследований. Клетки линии М-20 чувствительны к заражению различными вирусами. Дополнительно изучен цитокиновый спектр линии М-20. Знание цитокинового спектра клеток позволяет более точно оценивать результаты при определении интерферонового статуса больных и давать обоснованные рекомендации по применению лечебно-профилактических препаратов.

Диплоидные клетки человека - фибробласты штамма М-20 с повышенной пролиферативной активностью, получаемые предлагаемым способом, могут быть использованы для диагностических целей, в частности для определения активности интерферона (ИФН) в сыворотке крови человека, а также в лечебных целях, например для местного лечения пролежней, укушенных ран, длительно не заживающих и ожоговых ран.

1. Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека, отличающийся тем, что диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл.

2. Способ по п.1, в котором при культивировании клеток используют питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению клеток плацентарного перфузата человека в получении лекарственного средства для подавления пролиферации опухолевых клеток у индивида.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и онкологии. Способ предусматривает: а) выделение постнатальных тканеспецифичных мультипотентных аутологичных стволовых клеток (АСК) и/или аутологичных прогениторных клеток (АПК) для их последующего протеомного и полнотранскриптомного анализов; б) выделение АСК и/или АПК и/или мультипотентных аллогенных HLA-гаплоидентичных стволовых клеток (HLA-CK) для последующего ремоделирования их протеомного профиля; в) выделение РСК из опухоли пациента; г) протеомный анализ АСК и/или АПК и РСК; д) полнотранскриптомный анализ АСК и/или АПК и РСК; е) определение набора белков, каждый из которых содержится в протеомных профилях как АСК и/или АПК, так и РСК; ж) анализ ранее определенного набора белков для идентификации в РСК внутриклеточных сигнальных путей, не подвергшихся неопластической трансформации в результате канцерогенеза, и определения белков-мишеней, являющихся мембранными акцепторами идентифицированных сигнальных путей; з) анализ полнотранскриптомного профиля экспрессии генов РСК и подтверждение сохранности и функциональной значимости структурных компонентов идентифицированных сигнальных путей в РСК; и) определение белков-лигандов, способных активировать белки-мишени; к) сравнительный анализ полнотранскриптомных профилей АСК и/или АПК с транскриптомными профилями, содержащимися в известных базах данных транскриптомов, для определения пертурбогенов, способных модифицировать профиль экспрессии генов АСК и/или АПК и/или HLA-CK, выделенных для ремоделирования их протеомного профиля, в направлении секреции ранее определенных белков-лигандов; л) ремоделирование протеомного профиля АСК и/или АПК и/или HLA-CK пертурбогенами с получением модифицированного транскриптомного профиля различных клеточных систем, способных оказывать регуляторное воздействие на РСК пациента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Популяцию мононуклеарных клеток или неэмбриональных стволовых клеток, обогащенную клетками моноцитарной линии дифференцировки, содержащей промоноциты, применяют для лечения ишемии у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной технологии. Заявленное изобретение направлено на создание плюрипотентных, мультипотентных и/или самообновляющихся клеток, которые способны начать дифференцироваться в культуре в различные типы клеток и способны к дальнейшей дифференцировке in vivo.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для отбора сперматозоидов в методах вспомогательных репродуктивных технологий. Способ предусматривает размещение в чашке Петри капли спермы и капли культуральной среды на расстоянии друг от друга не более 5 см, соединение капель полосой из вязкой среды с параметрами вязкости 1-4 Па·с, затем инкубируют чашку с содержимым в течение 30-90 мин в условиях, моделирующих естественную среду цервикального канала женского репродуктивного тракта.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и клеточных технологий. Способ дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой линию клеток человека, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включает обработку плюрипотентных стволовых клеток средой, отличающейся тем, что она не содержит активин А и содержит GDF-8, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы плюрипотентные стволовые клетки дифференцировались в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены варианты олигопептида, выделенные из белка RAB6KIFL (KIFL20A), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в составе комплекса с молекулой HLA-A*0201.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и представляет собой способ пивоварения, включающий добавление к суслу термостабильной протеазы после фильтрации сусла, но перед варкой сусла, причем термостабильность протеазы означает, что активность этой протеазы составляет по меньшей мере 70% ее активности, измеренной согласно следующему методу: протеазу разводят до концентрации 1 мг/мл в аналитическом буфере, содержащем 100 ммоль сукциновой кислоты, 100 ммоль HEPES, 100 ммоль CHES, 100 ммоль CABS, 1 ммоль СаСl2, 150 ммоль КСl, 0,01% Тритон Х-100, и с рН, доведенным до 5,5 с помощью NaOH; после чего протеазу преинкубируют i) во льду и ii) 10 мин при 70°С; субстрат, к которому протеаза проявляет активность, суспендируют в 0,01% Тритоне Х-100: для начала реакции в пробирку добавляют 20 мкл протеазы и инкубируют в термомиксере Эппендорфа при 70°С, 1400 об/мин в течение 15 минут; реакцию останавливают помещением пробирок в лед; образцы центрифугируют холодными при 14000 g в течение 3 минут и измеряют оптическую плотность OD590 супернатанта; полученное значение OD590 образцов без протеазы вычитают из полученного значения OD590 образцов, обработанных протеазой; определяют термостабильность протеазы посредством расчета процентной активности протеазы в образцах, преинкубированных при 70°С, относительно активности протеазы в образцах, инкубированных во льду, как 100%-ной активности.

Изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани в тканях и органах включает выделение стромальных клеток жировой ткани, культивирование выделенных клеток в присутствии фактора некроза опухолей-альфа в количествах 5 или 100 нг/мл в течение 24-72 часов с последующим трансплантированием в ткани или органы.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и тканевой хирургии. Способ получения культуры гладкомышечных клеток заключается в том, что вырезают фрагмент кровеносного сосуда, измельчают его на кусочки до размеров не более 2 мм в любом измерении и инкубируют кусочки в культуральном флаконе с предварительно нанесенными на дно флакона царапинами, содержащем среду для культивирования, содержащую 10% эмбриональной фетальной сыворотки, в течение по меньшей мере 10 дней, но не более 24 дней, при температуре 37°С в условиях СО2-инкубатора, отличающийся тем, что упомянутым фрагментом кровеносного сосуда является фрагмент восходящего отдела грудной аорты, вырезаемый в ходе процедуры аортокоронарного шунтирования, а упомянутые кусочки фрагмента восходящего отдела грудной аорты перед инкубированием выдерживают в среде для культивирования, содержащей 0,1% коллагеназы, в течение по меньшей мере 30 минут, но не более 60 минут, при температуре 37°С, после чего промывают средой для культивирования клеток.

Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом // 2528250

Изобретение относится к области генетической инженерии, тканевых технологий и медицины. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных линий стволовых клеток человека включает получение эмбриоидных телец из плюрипотентных стволовых клеток человека, прикрепление эмбриоидных телец к чашке Петри для индукции спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки, культивирование с пролиферацией мезенхимальных стволовых клеток при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, и где индукция спонтанной дифференцировки стадии происходит путем формирования петель аутологичного цитокина без добавления внешнего цитокина, также соответствующие клетки, их применение, набор и способ культивирования.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.

Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой дерматологический крем, предназначенный для местного лечения бактериальных инфекций кожи и для заживления связанных с ними ран, содержащий фрамицетина сульфат и биополимер, включенные в кремовую основу, которая содержит по крайней мере одно вещество из каждой следующей группы: консервант; первичный и вторичный эмульгатор, выбранные из группы, содержащей кетостеариловый спирт, кетомакрогол 1000, полисорбат-80 и Span-80; парафин в качестве воскообразного продукта; совместный растворитель, выбранный из группы, включающей пропиленгликоль, гексиленгликоль и полиэтиленгликоль-400; азотную кислоту или молочную кислоту и воду, а указанный биополимер предпочтительно является хитозаном.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа с получением банка рабочих клеток 16 пассажа. При этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных иили диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10 фибринолитически активной плазмы человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пгмл. Изобретение позволяет повысить пролиферативную активность диплоидных клеток фибробластов человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

А рабский поэт XI века Аль-Маарри воскликнул однажды с горечью: «Нам кажется, юности нет износа, но катятся годы камнями с откоса». С тех пор минули столетия. Ученые и медики не тратили время впустую: они трудились, чтобы подарить человечеству методики, способные замедлить процесс старения. Одной из самых совершенных омолаживающих технологий является терапия фибробластами – надежная и безопасная процедура, обеспечивающая поразительный результат. Она позволяет вернуть весну жизни – время, когда мы превосходно выглядим даже после бессонной ночи. Если Ваша кожа требует истинного омоложения, а Вы хотите с каждым днем выглядеть все моложе, достичь желаемого результата помогут современные клеточные технологии.

П ередовые клиники Европы и США уже давно взяли на вооружение прогрессивную методику омоложения фибробластами. За последние 7 лет несколько тысяч американцев участвовали в клинических испытаниях этой технологии, которые показали поразительный эффект омоложения, наступающий у некоторых пациентов уже через несколько недель, у других – только через несколько месяцев. После введения фибробластов пациенты отмечают длительное улучшение качества кожи, позитивные эффекты которого накапливаются до 18-24 месяцев и остаются стабильными 7 лет и более. Результаты исследований оказались настолько убедительными, что процедура была одобрена многими авторитетными медицинскими институтами (например, МСА (Агентство Контроля и управления Лекарств)).

Е ще недавно нашим соотечественникам приходилось отправляться в Англию, Швейцарию или Соединенные Штаты и платить там огромные суммы денег, чтобы пройти курс клеточной терапии. Сегодня процедуры с применением аутологичных фибробластов доступны и в России.

И сследованиям фибробластов в нашей стране посвящена не одна докторская диссертация, их изучением занимаются многие серьезные медучреждения (например, Институт хирургии им. А. В. Вишневского РАМН). Почему же эти клетки человеческого организма вызывают столь сильный интерес ученых? Все дело в их беспрецедентном омолаживающем потенциале. В них таится та самая волшебная формула вечной юности, которую люди пытались вывести в течение многих столетий.

Что такое фибробласты и для чего они нужны?

Слово фибробласт содержит два корня – «fibra», что в переводе означает «волокно», и «blastos» – «росток». Фибробласты – это клетки соединительной ткани, которые имеют ядро и характеризуются округлой или веретенообразной формой и множеством отростков. Это наиболее ценные клетки среднего слоя кожи (дермы), входящие в состав стромально-васкулярной фракции, принципиально разделяющейся на 2 группы:

1. Васкулярные (сосудистые) клетки: эндотелиальные, перициты, гладкомышечные, циркулирующие клетки крови – эритроциты, лейкоциты, моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты, преадипоциты.

2. Фибробластоподобные клетки, к которым относятся непосредственно фибробласты и их предшественники – стромальные (они же мультипотентные, мезенхимальные) стволовые клетки.

Не является публичной офертой! Имеются противопоказания. Перед использованием необходима консультация специалиста.

Исходя из вышеприведенной классификации, становится понятно, что фибробласты – это не стволовые клетки, а их более зрелые и высокоорганизованные последователи. В отличие от стволовых клеток, которые могут дать начало клеткам любой ткани нашего организма, фибробласты могут превратиться только в малоактивный фиброцит.

Без фибробластов сохранение структурной целостности соединительной ткани не представлялось бы возможным, поэтому роль фибробластов трудно переоценить – это мощные фабрики, которые вырабатывают и постоянно обновляют структурные компоненты дермы и межклеточного вещества, а также множество биологически активных веществ, влияющих на процессы регенерации:

1. Именно фибробласты синтезируют составные компоненты соединительной ткани, ради воспроизводства которых разрабатываются самые современные и высокотехнологичные косметологические процедуры. Речь идет о коллагене, эластине и гиалуроновой кислоте – натуральных веществах дермы, обеспечивающих ее тургор, упругость, эластичность и увлажненность. Благодаря фибробластам вырабатываются также протеогликан, фибронектин, хондроитинсульфат, ламинин и другие элементы межклеточного матрикса, отвечающие за красоту и здоровье кожи.

2. Фибробласты постоянно обновляют дерму и не позволяют накапливаться в ней поврежденным волокнам. Ферменты, которые выделяются фибробластами, разрушают отжившие свой срок, старые и поврежденные эластин, коллаген и гиалуроновую кислоту, при этом заменяя их новыми и здоровыми. Процесс разрушения-восстановления проходит непрерывно, обеспечивая обновление межклеточного вещества. Особенно интенсивно происходит обмен гиалуроновой кислоты.

3. Фибробласты – это уникальные лекари нашего организма. При любом повреждении они с током крови «сбегаются» в очаг травмы и обеспечивают максимально быстрое восстановление разрушенных участков, заживление ран и эпителизацию (быстрое восстановление эпидермиса – поверхностного слоя кожи).

П ервая задача, которую преследуют фибробласты – восстановление барьера для поддержания постоянства внутренней среды, т.е. «залепить дырки». Поэтому они начинают очень активно делиться и в авральном режиме вырабатывать молекулы соединительной ткани, которые в спешке формируются крупные, грубые, незрелые, располагающиеся в тканях хаотично. Так появляется первый рубец – красный, плотный, неэластичный, «слабый».

Ф ибробласты размножаются гораздо быстрее, чем клетки эпидермиса, поэтому, если повреждение базальной мембраны больше 5 мм, то рубец выйдет на поверхность. Если меньше, то восстановится полнослойная кожа.

З атем фибробласты начинают вырабатывать ферменты, разрушающие волокна и постепенно замещать их зрелыми, эластичными, структурными. И рубец бледнеет, становится эластичным, тонким, прочным.

4. Отвечают фибробласты и за регенерацию кожи (восстановление, обновление), так как именно они продуцируют очень важные факторы роста – регуляторные белки (тканевые гормоны), функцией которых является стимуляция деления и роста клеток дермы и эпидермиса, а также формирования новых сосудов. Перечислим только некоторые факторы роста, вырабатываемые фибробластами:

Основной фактор роста фибробластов (bFGF) отвечает за формирование и развитие всех типов клеток кожного покрова, заставляет фибробласты активно вырабатывать коллагеновые и эластиновые волокна, гиалуроновую кислоту.

Трансформирующий ростовой фактор (TGF-бета) отвечает за быструю регенерацию поврежденной дермы. Он притягивает фибробласты к месту повреждения и активизирует выработку ими коллагеновых волокон и фибронектина – веществ, обеспечивающих восстановление травмированной кожи.

Трансформирующие ростовые факторы (TGF-альфа, a-NGF) вызывают неоангиогенез – процесс формирования новых сосудов в коже.

Эпидермальный фактор роста (EGF) ускоряет деление и созревание кератиноцитов.

Фактор роста кератиноцитов (KGF) ускоряют процессы заживления и эпителизации ран, стимулируя размножение и развитие клеток эпидермиса (кератиноцитов).

5. Травма является для фибробластов своего рода сигналом, заставляющим их делиться в ускоренном темпе и продуцировать факторы роста, которые в свою очередь притягивают к очагу повреждения фибробласты и другие клетки, обеспечивающие восстановление поврежденной ткани.

Уникальные свойства фибробластов

1. Клетки нашего организма не могут размножаться бесконечно и их количество сокращается приблизительно на 10-15 % каждые 8-10 лет. Причем процесс идет в геометрической прогрессии. Это связано с тем, что при каждом делении клетки утрачивается небольшой фрагмент ДНК. Поначалу теряются участки ДНК (теломеры), не несущие важной информации для функционирования клетки. С каждым делением длина теломеров уменьшается и когда они «заканчиваются» и возникает угроза потери фрагментов ДНК, несущих значимую информацию для клетки, ее деление прекращается. Максимально возможное количество делений составляет в среднем 50 ± 10 и называется «предел Хейфлика», в честь американского ученого, в 1961 году открывшего этот феномен. Отсчет количества делений начинается в эмбриональном периоде и после того, как исчерпывается лимит, начинается старение клеток, тканей и организма в целом.

2. Ранее существовало мнение, что с течением времени фибробласты утрачивают способность к делению и превращаются в фиброциты – зрелые клетки, отличающиеся малой активностью. Однако в результате научных исследований было выяснено: несмотря на то, что количество фибробластов с возрастом уменьшается, они не теряют свои функциональные качества и по-прежнему способны делиться, но по какой-то причине перестают это делать, просто «засыпают» и при необходимости могут переходить вновь в активную форму. По всей видимости, причина этого кроется в наличии фермента теломеразы, которая после каждого деления клетки восстанавливает длину теломера, тем самым увеличивая количество делений фибробласта. Впервые этот механизм, обеспечивающий способность бесконечного деления, был обнаружен у стволовых клеток.

Э то открытие повлекло за собой разработку методики культивирования аутологичных фибробластов с их последующей трансплантацией в дерму пациента. Процедура является по сути дела воплощением мечты о вечной молодости, ведь она предполагает не только устранение возрастных признаков, но и воздействие на саму причину увядания кожи.

3. Возраст донора фибробластов не имеет значения для продолжительности их жизни, функциональной активности и способности к делению. Этот феномен связан с тем, что в процессе культивирования происходит их омоложение. К такому выводу пришел Cristofalo с соавторами, проведя многолетние исследования. По его мнению, в лаборатории клетки возвращаются в состояние, характеризующееся высокой функциональной активностью и приближающее их по свойствам к мезенхимальным стволовым клеткам.

4. В процессе выделения фибробластов из кусочка кожи пациента получается первичная культура клеток, содержащая как молодые, так и старые клетки. Далее все эти клетки помещаются в среду, содержащую эмбриональную сыворотку, т.е. в условия, которые наблюдаются в эмбриональном состоянии. При этом стимулируется деление молодых клеток, сохранивших высокие способности к росту, и разбавление или вымывание из культуры старых клеток, которые потеряли способность к пролиферации. Таким образом, культура как бы омолаживается. Помимо этого, по данным Makinodan, старые клетки в подобных условиях реактивируются и в последующем, при введении в дерму заселяют ее и усиленно синтезирует весь комплекс компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста, необходимый для поддержания кожи пациента в оптимальном физиологическом состоянии.

Важно отметить, что речь идет о собственных клетках пациента, которые, взрослея, не будут поглощаться макрофагами в отличие от пересаженных донорских клеток.

5. В процессе культивации фибробласты утрачивают ген чужеродности, а также они неспособны вызывать онкологию, что позволяет использовать для терапии «чужие» - донорские клетки, что уже доказано многолетними клиническими испытаниями. Впервые методика культивирования фибробластов появилась в 1968 году и применялась для ускорения заживления ран. В 1998 году FDA одобрила первый клеточный продукт на основе фибробластов Apligraf для применения в камбустиологии (лечения ожогов). И только после этого появилось новое направление в эстетической медицине, а именно терапия фибробластами возрастных изменений, а в стоматологии – лечение гингивитов. Правда, поначалу применялись только донорские фибробласты.

Механизм действия такого метода связан со способностью фибробластов синтезировать коллаген, эластин, гиалуроновую кислоту и другие компоненты межклеточного вещества, а также факторы роста, что ускоряет деление и рост эпителия, и в конечном итоге приводит к восстановлению поверхностного и среднего слоя кожи – эпидермиса и дермы.

6. При любом термическом поражении кожи (ожоге или отморожении) происходит повреждение кожи, а степень выраженности воспалительных явлений и длительность (а подчас и способность к восстановлению) зависит от глубины ее поражения:

I степень – покраснение, отек кожи (стихают через 3-4 дня) и боль (сохраняется 1-2 дня) вследствие обратимого поражения поверхностных слоев эпидермиса. В косметологии такое повреждение кожи наносится специально с помощью поверхностных химических или лазерных пилингов с целью омоложения.

I I степень – образование пузырей, наполненных прозрачным содержимым в результате гибели слоев эпидермиса (до базального, росткового слоя) и их отслойкой. На месте ожога в течение некоторого времени держатся сильные боли и жжение, однако в течение 10-14 дней происходит полное восстановление целостности эпидермиса без образования рубцов. Соответствует срединным пилингам.

IIIа степень – неполный некроз кожи с сохранением дермы и ее производных - потовых и сальных желез, волосяных луковиц, из эпителия которых происходит самостоятельное восстановление эпидермиса в течение 4–6 недель, иногда с образованием рубцов кожи с участками гипер- и депигментации.

IIIб степень – полный некроз всей толщи кожи.

IV степень – омертвение кожи и тканей, под ней расположенных. Эпителизация в таких случаях возможна лишь с краев раны и происходит она очень медленно. Самостоятельно может зажить только рана небольших размеров, т.к. возможности восстановления эпидермиса по краям раны составляют не более 5 мм.

Важным признаком, отличающим IIIа и IIIб степень, является сохранение болевой чувствительности в первом случае. У детей до полового созревания довольно часто такие ожоги заживают с формированием гипертрофических рубцов. На таком уровне выполняется глубокая лазерная шлифовка или глубокий химический пилинг кожи. Возможно это только на лице, которое характеризуется очень большим количеством придатков кожи, высокой способностью к регенерации, очень активным обменом веществ в клетках и кровоснабжением. На остальных участках кожи нашего тела такое агрессивное воздействие неизбежно приводит к формированию рубцов.

При поверхностных ожогах I, II и IIIа степени фибробласты наносят для комплексного лечения ран большой площади с целью ускорения эпителизации. При глубоких – в сочетании с пересадкой собственной кожи, которой при этом необходимо гораздо меньше.

7. Аутологичные (собственные) и донорские культивированные фибробласты не вызывают аллергических реакций или онкогенеза после трансплантации. Организм распознает их как свои, а не чужеродные клетки, поэтому и не включает механизм защиты от них.

Важный нюанс – омолаживающее действие собственных культивированных фибробластов является гораздо более пролонгированным, чем аналогичное действие донорских клеток. Последних со временем все же распознают и поглощают иммунные клетки нашего организма, поэтому результат остается стабильным не более 2-х лет .

Особенности старения

А мериканские ученые опубликовали данные, согласно которым после 44 лет для женщин (исходя из средней продолжительности жизни, составляющей 78,8 лет) и после 40 лет для мужчин (исходя из средней продолжительности жизни, составляющей 72,6 года) человек неминуемо начинает сталкиваться с болезнями. Другими словами, почти половину жизни он обречен угасать, страдая от недугов и немощи. Первые признаки деструктивного процесса старения появляются уже в 30-летнем возрасте. Ситуацию усугубляет современный ритм жизни, сопряженный с психическими перегрузками, который самым пагубным образом влияет на организм человека.

К ак уже говорилось выше, благодаря деятельности фибробластов постоянно происходит обновление дермы за счет баланса двух разнонаправленных процессов: разрушение отживших, старых волокон и синтез новых. НО, в определенный момент по какой-то причине (до сих пор не ясной, т.к. начаться это явление может у людей в разном возрасте) снижается способность фибробластов к делению и синтезу веществ. Вместе с тем процесс разрушения старых волокон будет продолжаться еще долгое время, что повлечет за собой уменьшение объема соединительной, мышечной, костной и других видов тканей. Т. е. процесс разрушения начинает преобладать над процессом созидания.

Благодаря предусмотренному природой резерву клеток, последствия дисбаланса остаются не слишком заметными в течение нескольких лет. Между тем после 40-45 лет избежать возрастных изменений не удается никому и подчас они настигают нас лавинообразно, а многих женщин этот период связан с наступлением менопаузы и началом гормонального старения. Именно поэтому Виктор Гюго назвал данный возраст «старостью юности». Спустя время процесс гибели клеток и тканей останавливается, вновь устанавливается баланс между созидательными и разрушительными процессами, однако к этому возрасту человек превращается уже в «усохшего» старичка или старушку. В стареющей коже уменьшается толщина дермы, содержание влаги в ней падает, в результате кожа теряет упругость и эластичность. Следствием этого является растяжение кожи и образование морщин.

П роцессы обновления и регенерации тканей замедляются, что влечет за собой неприятные последствия:

- базальный (ростковый, регенераторный) слой становится тоньше, образуется все меньше кератиноцитов;

Истончаются клетки эпидермиса (роговые чешуйки);

Процесс удаления роговых чешуек с поверхности кожи замедляется, в результате чего роговой слой становится толще;

Дерма стремительно теряет толщину, количество и размер фибробластов, макрофагов, тканевых базофилов и других клеток дермы уменьшается. Они перестают справляться со своими функциями, что рано или поздно приводит к дефициту коллагена, эластина и межклеточного вещества. Начиная примерно с 25-летнего возраста, синтез коллагена и эластина – волокон, благодаря которым кожа выглядит упругой и здоровой – сокращается ежегодно на 1 % ;

Деформируется структура эластиновых и коллагеновых волокон: они становятся толще, ригиднее, чем должны быть в норме, нарушается упорядоченность их расположения;

В организме вырабатывается все меньше гиалуроновой кислоты, что влечет за собой утрату увлажненности дермы, приводит к пересушенности кожи, образованию на ней микротрещинок и морщин, снижению ее эластичности и тургора;

Ухудшается кровоснабжение и поступление питательных веществ к клеткам дермы;

Восстановительные процессы протекают медленно.

Вышеперечисленные изменения не могут не сказываться на внешнем виде кожного покрова. Постепенно нарастает чувство сухости и стянутости кожи, кожный покров становится дряблым, тонким, неэластичным, покрывается мелкими морщинами и пигментными пятнами. Со временем все эти признаки старения накапливаются и приобретают явную выраженность. Особенно быстро стареют открытые участки кожи и места сгибов.

Омоложение фибробластами останавливает процесс старения

Н асыщение дермы молодыми фибробластами – максимально естественный, эффективный метод омоложения и профилактики старения, так как он позволяет возродить структуру дермы, а у возрастных пациентов является заместительной терапией.

У никальная процедура клеточного омоложения кожи, основанная на применении аутологичных фибробластов, останавливает процесс снижения запасов собственных клеток дермы. Методика не просто корректирует возрастные изменения, а воздействует на них на уровне микротекстуры: молодые фибробласты омолаживают дерму изнутри, а также стимулируют активность тех фибробластов, которые имеются в организме. Как следствие, повышается скорость деления клеток, быстрее обновляется поверхностный слой кожи, формируются новые молодые коллагеновые и эластиновые волокна, увеличивается содержание в дерме гиалуроновой кислоты. Вы снова наслаждаетесь видом сияющей бархатистой кожи, надолго забываете о морщинах, расширенных порах, пигментных пятнах, шелушении и сухости.

К леточная терапия справляется даже с растяжками – дефектами, которые практически невозможно устранить с помощью прочих малоинвазивных методик. Фибробласты не просто останавливают биологические часы, а заставляют их идти в обратном направлении. А если, спустя какое-то время их активность снизится и они заснут, то простые методы физической травмы, проникающей в дерму (такие как диодное и углекислотное лазерное омоложение кожи), вновь их разбудят и заставят долгое время трудиться, многократно усиливая омолаживающий эффект.

В ведение в дерму культивированных в условиях лаборатории фибробластов позволяет вернуть коже свойственные молодости эластичность и упругость. Более того, если в последующем вы будете делать косметологические процедуры или пластические операции, то получите гораздо более выраженный эффект, чем те, кто не активировал предварительно собственные фибробласты и не пополнил их запас.

С казочный эффект использования аутологичных фибробластов оценили уже многие знаменитости. Ведь результаты процедуры действительно поразительны: сеть мелких морщин бесследно исчезает, глубокие складки разглаживаются. День за днем вы наблюдаете в зеркале, как кожа становится все более сияющей и упругой, улучшается ее тонус, разглаживается сеть мелких морщин, а цвет лица становится здоровым. Шея и руки больше не выдают возраст – кожа этих частей тела приобретает подтянутый вид и наполненность. Трансплантация культивированных фибробластов повышает защитно-барьерные свойства кожи, а значит неблагоприятные факторы и стрессы не смогут украсть молодость и красоту.

Т ерапия аутологичными фибробластами значительно эффективнее, чем инъекции Ботокса, которые при длительном и частом применении может вызывать повреждение нервных окончаний и нарушение питания кожи.

П омимо этого, введение фибробластов более результативно, чем заместительная терапия гиалуроновой кислотой, которая омолаживает кожу на небольшой промежуток времени, а затем их необходимо повторять. При частом использовании и с течением времени, на искусственную гиалуроновую кислоту организм начинает вырабатывать антитела, и разрушение введенных препаратов происходит все быстрее. Кроме того, введение избытка (особенно в возрасте до 35 лет!) гиалуроновой кислоты, оказывает тормозящее влияние на синтез структурных компонентов кожи фибробластами, тем самым косвенно ускоряя старение.

Показание к терапии фибробластами:

Профилактика старения – инъекции можно начинать с 40 лет, тем самым выполняется заместительная терапия;

Омоложение кожи лица, шеи, декольте, рук устраняет признаки старения: истонченность, дряблость, сниженный тургор и эластичность, пигментацию, атрофичность и мелкую морщинистость;

Улучшение качества кожи тела: живота, спины, бедер. Терапия фибробластами усиливает эластичность и тонус, тем самым оказывая лифтинговый эффект;

Устранение пигментации вокруг глаз;

Ускорение «созревания» молодых рубцов – в «возрасте до 12 месяцев;

Лечение постакне рубцов;

Лечение растяжек;

Подготовка к пластическим операциям и быстрое восстановление после них;

Ускорение восстановления после пилингов, лазерных процедур и т.д.

Противопоказания к терапии фибробластами:

Острые инфекционные заболевания;

Обострение хронических болезней;

Аутоиммунные заболевания соединительной ткани;

Склонность к келоидным и гипертрофическим рубцам;

Онкологические заболевания;

Длительная терапия стероидами;

Беременность, лактация.

Терапия фибробластами

Е сли говорить о терапии аутологичными фибробластами просто, то она состоит из нескольких этапов:

1. Забор кусочка кожи. Его можно брать на любом участке тела, важно только соблюсти размер – около 5*1,5 см. От размера забранного участка кожи зависит количество фибробластов, которое получат в лаборатории «Покровского банка стволовых клеток» (с которым сотрудничает наша клиника). Для того чтобы правильно насытить кожу молодыми клетками, за одну процедуру необходимо (по специальной методике!) ввести достаточное количество фибробластов (около 2-3 миллионов в 1 мл). Поэтому технологи лабораторий просят кусочек кожи побольше.

Наиболее часто мы его забираем, иссекая здоровую кожу по ходу существующих на теле рубцов от ранее перенесенных операций или травм, а при их отсутствии из области паха. После забора необходимого участка, ранка зашивается послойно, заканчивая внутрикожным швом, который мы снимаем на 7-10 день после операции. В последствие на этом месте останется тонкий малозаметныйнитевидный шов, который легко прячется даже в самых открытых трусиках.

Для выполнения данного этапа требуется сдать анализы крови: общий клинический, биохимический (глюкоза, АЛТ, АСТ, билирубин, мочевина, креатинин) и коагулограмму.

Для выделения и культивирования фибробластов подходит кожа, удаленная в ходе эстетических операций (подтяжка лица, блефаропластика, абдоминопластика и т.д.). Многие пациенты хотят в последующем повторить процедуру, и технологи сразу культивируют две порции фибробластов, одну из которых хранят в криогенной камере до нужного момента – чтобы не пришлось в следующий раз забирать кусочек кожи.

2. Выделение и культивирование фибробластов в лаборатории «Покровского банка стволовых клеток»: кусочек кожи измельчается, обрабатывается специальными ферментами, промывается физиологическим раствором. Потом вышедшие при этом клетки осаждаются в центрифуге и высеваются на специальную питательную среду. Размножаются до необходимого количества, снимаются с подложки, очищаются от остатков среды, осаждаются в центрифуге.

3. Очень важна система контроля качества полученных в результате культивирования фибробластов. Для этого ежедневно контролируют и удаляют из культуры клетки, обладающие онкогенным потенциалом: ежедневный контроль формы, строения, активности размножения клеток, а также исследование ДНК и при необходимости – уровня экспрессии (выделения) онкогенных маркеров. Помимо этого, контроль качества включает анализ на бактериальную загрязненность и на отсутствие вирусов ВИЧ, гепатитов. На каждую порцию клеток предоставляется паспорт фибробластов, в котором указывается ФИО донора, дата, время изготовления, количество клеток в 1 мл, и отрицательные результаты тестов на онкогенность и инфекции.

Далее возможны варианты – они либо вводятся в физиологическом растворе методом мезотерапии (для омоложения), либо помещаются на специальный гелевый носитель (для заживления ран и ожогов). Занимать весь этот процесс может от 4 до 6 недель.

4. Каждая порция клеток готовится не только к определенной дате, но и заранее оговоренному времени, т.к. фибробласты вне тканей человека уязвимы и должны быть введены в течение 6 часов, т.к. после этого они погибнут. Вводятся фибробласты 5 раз с интервалом 2 недели, мезотерапевтической техникой, в верхние слои кожи. Такая методика обеспечивает стабильность результата и омолаживающий эффект. При этом хорошо работает правило: чем больше площадь обработки, тем значительнее омоложение.

Р езультат от терапии собственными фибробластами накопительный, он появляется на уровне ощущений спустя 1-1,5 месяца от начала процедур (как правило, к третьей) и затем постепенно усиливается до 12-18 месяцев, а затем остается стабильным от 5 лет и более. Это метод естественного омоложения кожи, абсолютно безопасный, высокоэффективный и «долгоиграющий». Введение фибробластов направлено на улучшение качества кожи, т.е. ее тургора, тонуса, цвета, плотности и т.д., НО никогда не приводит к лифтингу !

Е сли же Вы начали замечать, что фибробласты снижают свою активность – их легко простимулировать лазерной терапией (СО, диодный, неодимовый лазеры, действующие надерму), эффект от которой будет намного выраженнее и заметнее.

Тело человека состоит из триллионов разнообразных клеток. Каждый орган в нашем теле, каждая структура и квадратный сантиметр ткани насчитывает миллиарды клеток, от правильной работы которых зависит состояние всего организма. Наиболее важными клетками самого большого органа в теле человека - кожи , являются фибробласты. Их называют клетками молодости, так как именно активная работа фибробластов способствует поддержанию молодости и красоты кожи. Сегодня на сайт читайте важную информацию о фибробластах, которой обязательно должен владеть каждый специалист эстетической медицины.

Фибробласты кожи: функции и особенности строения

Фибробласты - это клетки соединительной ткани организма. Их предшественниками являются стволовые клетки , имеющие мезенхимное происхождение.

В организме человека фибробласты могут находиться в двух формах.

Активный фибробласт имеет большой размер, отростки, овальное ядро и много рибосом. Такая клетка может делиться и интенсивно вырабатывать коллаген. Неактивные фибробласты называются также фиброцитами. Они являются высокодифференцированными клетками, которые образовываются из фибробластов, не имеют способности к делению, но принимают активное участие в синтезе волокнистых структур и заживлении ран. Неактивные фибробласты имеют несколько меньший размер, чем активные, и отличаются веретенообразной формой.

Фибробласты:

структурно-функциональные типы активных фибробластов;
продукты синтеза фибробластов - компоненты внеклеточного матрикса;
основные функции фибробластов в организме человека.

Структурно-функциональные типы активных фибробластов

Все активные фибробласты разделяются на несколько структурно-функциональных типов, каждый из которых выполняет определенные функции:

малодифференцированные фибробласты обладают выраженными пролиферативными свойствами, то есть, они активно размножаются и растут;
юные фибробласты - более дифференцированные клетки, которые также способны к пролиферации, но, в отличие от малодифференцированных, могут синтезировать коллаген и кислые гликозаминогликаны;
зрелые фибробласты образуются из юных форм, практически не могут размножаться, и разделяются на три подтипа:
фиброкласты разрушают коллаген путем фагоцитоза и внутриклеточного лизиса;
коллагенобласты синтезируют коллаген ;
миофибробласты играют роль в сокращении фиброзной ткани при заживлении ран.

Продукты синтеза фибробластов - компоненты внеклеточного матрикса

Фибробласты располагают в среднем слое кожи человека - в дерме . Там они вырабатывают внеклеточный матрикс, компоненты которого и формируют своеобразный каркас кожи. Основными компонентами внеклеточного матрикса являются гликопротеины, протеогликаны и гиалуроновая кислота. Широко известный коллаген, о котором знает не только каждый специалист, но и практически каждый пациент, является превалирующим гликопротеином внеклеточного матрикса. Кроме того, фибробласты продуцируют также белки фибрин, эластин, тинасцин, нидоген и ламинин, которые используются в качестве «строительных материалов» для кожи. Еще один продукт синтеза фибробластов - это факторы клеточного роста , к которым относятся:

основной фактор, усиливающий рост всех клеток кожи;
трансформирующий фактор, способствующий стимулированию выработки эластина и коллагена;
эпидермальный фактор, ускоряющий деление клеток и перемещение кератиноцитов;
фактор роста кератиноцитов.

Основные функции фибробластов в организме человека

Зная о том, что именно вырабатывают клетки дермы фибробласты, можно разобраться в широком спектре их функций, к которым относятся:

синтез коллагена, эластина, гиалуроновой кислоты и других компонентов внеклеточного матрикса;
формирование сосудов;
усиление процессов клеточного роста;
ускорение разрастания тканей;
заживление повреждений кожи;
направление клеток иммунной системы к бактериям и другим чужеродным агентам.

Благодаря правильной работе фибробластов, кожа человека долгие годы сохраняет свой свежий, подтянутый и молодой вид.

Только понимая основные принципы работы этих клеток, специалист может грамотно разобраться в омолаживающих методиках ..