Сенная палочка описание. Сенная палочка

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для получения препарата из группы пробиотиков. Штамм бактерий Bacillus subtilis BKM В-2287 выделен из почвы. Клетки грамположительны, капсулы не образуют, образуют круглые споры, тип дыхания - аэробный. Гидролизует глюкозу, маннит, лактозу. Не сбраживает сахарозу, инозит, сорбит, мальтозу. Не образует газа при сбраживании. Подавляет рост стафилококков, кишечной палочки, энтеробактерий, цитробактерий, аэромонас. Штамм используют как производственный для получения пробиотического препарата, названного авторами "Субтилис+". Препарат нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, птицы, рыбы; перспективен в лечении и профилактике бактериальных инфекций. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, применяемого в ветеринарии при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Известен штамм Bacillus subtilis 534 - продуцент пробиотика “Споробактерин”, который предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов. SU 1708350, кл. А 61 К 35/66.

Недостатком является небольшие сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии, которые не могут длительное время сохранять свои свойства, низкая чистота препарата, что имеет узкую область применения - как кормовая добавка для животных. Штамм также чувствителен к антибиотикам за исключением полимиксина, что ограничивает сферу применения препарата.

Известен штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК №248), несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения пробиотического препарата “Бактиспорин”, который применяют совместно с антибиотиками для лечения и профилактики дисбактериоза, ферментной недостаточности органов пищеварения, гнойных инфекций, пищевой аллергии. RU 2067616 С1, кл. А 61 К 35/74, 10.10.1996.

Известен штамм Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, проявляющий ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладающий множественной лекарственной устойчивостью. Штамм резистентен к тетратциклину, рифампицину, аленициллину, хлорамфениколу, апректомицину. На его основе готовят антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одноименной антибиотикотерапии (RU 2118364 С1, кл. С 12 N 1/20, 27.08.1988).

Известен штамм Bacillus subtilis ВКМ B-2250 (RU №2184774, кл. А 61 К 35/74, 10.07.02), который является основой препарата для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление нового эффективного штамма-продуцента пробиотического препарата для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении эффективности лечения, увеличения усвояемости кормов, продуктивности и привесов животных, птицы, рыб за счет использования пробиотического препарата на основе предложенного штамма-продуцента, стабильности препарата при хранении в широком диапазоне температур внешней среды.

Штамм Bacillus subtilis Б-9 выделен из почвы, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. К.Г.Скрябина) под номером ВКМ В-2287.

Штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2287 может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 2 месяца на эту же среду.

Характеристики штамма.

Культурально-морфологические признаки. Палочки. Размер односуточной агаровой культуры 3-5 мкм. Клетки окрашиваются положительно по Грамму, образуют круглые споры, одиночные, центральные диаметры меньше диаметра клетки. Колонии на МПА белые, пигмент в среду не выделяют.

Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 37° С и рН 3,5-8,0. Возможен рост в диапазоне температур 4-50° С. Отношение к NaCl - рост при содержании до 3%.

Биохимические признаки. Расщепляет глюкозу, лактозу, маннит. Несбраживаемые соединения углерода: сахароза, инозит, сорбит, мальтоза, лактоза. Утилизирует цитрат и ацетат. При сбраживании не образует газа. Продуцирует оксидазу, каталазу.

Антагонистические признаки. Штамм Bacillus subtilis BKM В-2287 подавляет рост стафилококков, протея, клебсиелл, кишечной палочки, энтеробактерий, цитробактерий, аэромонас, дрожжевых грибов.

Штамм Bacillus subtilis BKM В-2287 не является патогенным для растений, животных, рыбы и человека.

Данные таблицы 1 показывают антагонистическую активность тестовых штаммов микроорганизмов (метод отсроченного антагонизма).

Для культивирования штамма Bacillus subtilis BKM В-2287 используют жидкую питательную среду, содержащую гидролизат казеина - 5 см 3 · дм -3 (N aM =300 мг%); кукурузный экстракт - 80 см 3 · дм -3 (N aм =290 мг %), MnSO 4 5Н 2 О - 0,250 г-дм -3 ; MgSO 4 7H 2 O - 0,300 г-дм -3 ; FeSO 4 7H 2 О - 0,015 г-дм -3 ; CaCl 2 2Н 2 О - 0,052 г-дм -3 ; NaCl - 11,000 г-дм -3 , дистиллированную воду.

Предварительно сухую биомассу микроорганизмов высевают в пробирку с бульоном. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясопептонный агар в пробирки.

Отбирают типичные колонии, которые пересевают на жидкую среду во флаконах. Через 22 часа всю выросшую массу переносят в 20-литровую бутыль с 10-ю литрами питательной среды и культивируют 26 часов при 37-39° С, получая посевной материал.

Питательную среду на основе гидролизата казеина помещают в биологический реактор, стерилизуют 60 мин при 1 атм, охлаждают до 39° С и засевают посевным материалом из бутыли в соотношении 1:9.

В процессе аэробного культивирования рН среды поддерживают в пределах (6,8-7,2) ед. рН, подпитывая среду (10-15)% -ной глюкозой до конечной концентрации (0,1-0,2)%. При достижении биологической концентрации по БК (15-20) 10 9 кл.см -3 и (8-10) 10 9 кл.см -3 по БKt прекращают добавление глюкозы до снижения рН 4,0 и отключают подачу воздуха. Затем отключают обогрев реактора, среду охлаждают до (15-19)° С. Полученную охлажденную культуру перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.

При указанном способе культивирования получают пробиотический препарат в виде жидкой формы с содержанием (80-95)% спор и живых вегетативных клеток бактерий штамма Bacillus subtilis ВКМ В-2287.

Предложенный пробиотический препарат безвреден, не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела (18-20) г, которым перорально вводили препарат в объеме 1,0 мл.

Препарат обладает специфической активностью: количество клеток в одной дозе препарата (8-20)10 9 кл.см -3 , антагонистическая активность - зона задержки роста тестовых микроорганизмов составляет от 10 до 38 мм.

Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2287 может быть использован как производственный для получения препарата пробиотического действия, рекомендуемого для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыбы.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Испытания предложенного пробиотического препарата на новорожденных телятах и поросятах.

Эффективность препарата на основе предложенного штамма Bacillus subtilis ВКМ В-2287 была испытана на новорожденных телятах и поросятах с диагнозом диарея, протекавшей на фоне сложной эпизоотической обстановки в хозяйстве. Контрольные группы телят и поросят содержались согласно принятой в хозяйстве технологии. Телятам и поросятам опытных групп дополнительно задавали препарат на основе предложенного штамма Bacillus subtilis BKM В-2287 перорально с небольшим количеством воды за 20 минут до кормления в разовой дозе на голову по 15 мл телятам и по 20 мл поросятам три раза в сутки в течение трех суток. Наблюдения показали, что в опытных группах через сутки после дачи препарата улучшилось общее состояние всех животных, диарея прекратилась, а еще через двое суток все животные были практически здоровы. Состояние животных в контрольных группах характеризовалось продолжением состояния диареи, падеж составил 10% у телят и 22% у поросят.

Пример 2. Добавление пробиотического препарата “Субтилис+” в корм аквариумных рыб.

Проводилось кормление подрощенной молоди золотых рыб (оранда) экструдированным кормом с добавлением пробиотического препарата “Субтилис+”. Количество корма составляло 10 кг, добавленного пробиотика 1 мл. Количество рыб в опытной и контрольной группах составляло по 250 экз. Кормление осуществляли 4-6 раз в сутки. Корм поедался охотно. Темп роста молоди в опытной группе по сравнению с контрольной составил 22%. Выход рыб в опытной - 98%, в контрольной - 78%. Вода в аквариумах не портилась, мутность отсутствовала.

Пример 3. Сохранность цыплят в первые недели.

Проведены испытания “Субтилис+” на цыплятах бройлерной птицефабрики (по 5 птичников в опытной и в контрольной группах). Отход цыплят контрольной группы, не получавших пробиотик, составил 4%, опытных - 0,2%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес. После первых трех дней средний вес цыпленка в контрольной группе равнялся 61 г, в опытной - 70 г.

Проведенные испытания показали эффективность препарата “Субтилис+”, получаемого на основе предложенного штамма Bacillus subtilis BKM В-2287.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Bacillus subtilis BKM В-2287, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы.

Бациллюс субтилис или cенная палочка (лат. Bacillus subtilis ) - вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus ). Bacillus subtilis - один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов.

Название сенная палочка происходит из-за того, что ранее Bacillus subtilis изолировался исключительно из сенных отваров . Bacillus subtilis имеет вид бесцветной прямой палочки, размером примерно 0,7 мкм в толщину и 2-8 мкм в длину. Bacillus subtilis может размножаться делением и спорами. Иногда отдельные Bacillus subtilis , после поперечного деления, остаются соединенными в нити.

Bacillus subtilis (сенная палочка), благодаря продуцируемым антибиотикам и способности закислять среду обитания, является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла , протей , стафилококки , стрептококки , дрожжевые грибки; продуцируют ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей; синтезируют аминокислоты, витамины и иммунноактивные факторы. Некоторые штаммы Bacillus subtilis являются продуцентами гиалуроновой кислоты .

Bacillus subtilis может быть причиной пищевых отравлений человека (код по МКБ-10 A05.4).

Bacillus subtilis - действующее вещество лекарственных препаратов

Бациллюс субтилис (Bacillus subtilis ) - действующее вещество некоторых лекарственных препаратов. В данном контексте под термином «бациллюс субтилис» понимается определенный штамм (штаммы) бактерий вида Bacillus subtilis . По фармакологическому указателю бациллюс субтилис относится к группам «Противодиарейные средства» и «Другие иммуномодуляторы». По АТХ бациллюс субтилис имеет код «A07FA Антидиарейные микроорганизмы». Показания к применению бациллюс субтилис:

• острые кишечные инфекции у детей
• дисбактериоз кишечника различной природы
• бактериальный вагиноз
• профилактика гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде.

В качестве активного вещества лекарственных препаратов используется лиофилизированная микробная масса живого антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 534 или штамма Bacillus subtilis 3H,
селектированного по признаку хромосомной устойчивости к антибиотику - римфапицину из производственного штамма Bacillus subtilis 534. Российскими предприятиями 48 ЦНИИ Минобороны России ФГУ, г. Екатеринбург, ЗАО «Биофарма» и несколькими украинскими предприятиями производится лекарственный препарат Биоспорин , содержащий смесь Bacillus subtilis штамм 2335 (также называемый Bacillus subtilis 3) и Bacillus licheniformis 2336 (также называемый Bacillus licheniformis 31) в пропорции 3:1.

В России также зарегистрированы (были зарегистрированы) лекарства, в которых основным действующим веществом являлись Bacillus subtilis: (штамм 534), Бактиспорин (штамм N 3H).

Препараты на основе сенной палочки Bacillus subtilis (Споробактерин, Биоспорин, Бактиспорин) и сходного микроорганизма Bacillus cereus (Бактисубтил) обладают антимикробной активностью и могут использоваться при бактериальных инфекциях при невозможности приема антибиотиков или для селективной деконтаминации тонкой кишки при синдроме избыточного бактериального роста. Споры этих бактерий, превращаясь в толстой кишке в активные формы, вырабатывают в процессе жизнедеятельности кислые метаболиты - органические кислоты. При этом рН в толстой кишке сдвигается в кислую сторону и подавляется рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Белоусова E.А., Златкина А.Р.).

В состав лекарственного препарата Энзимтал , имеющего разрешение на применение на территории Украины (позже отозванном), имеется грибковая амилаза - амилолитический фермент, получаемый из грибов Aspergillus oryzae и непатогенных бактериальных культур Bacillus subtilis (Кирик Д.Л., Полякова И.Ф.).

Bacillus subtilis - пробиотик

Кроме перечисленных выше лекарств-пробиотиков , штаммы Bacillus subtilis входят в состав пищевых добавок. В России продаются (продавались) БАДы, содержащие Bacillus subtilis: Бактистатин, Супрадин Киндер гель (производство Германии), Ветом и другие.

БАД Бактистатин содержит метаболиты бесклеточной культуральной жидкости Bacillus subtilis штамм 3 (содержащей в том числе витамин Е), носитель цеолит, ферментированный гидролизат соевой муки, антислеживающий агент стеарат кальция (или аэросил), ингредиенты капсулы (желатин медицинский, титана диоксид, индиготин). Бактистатин рекомендуется разными авторами, в частности, для коррекции синдрома избыточного бактериального роста лёгкой степени (Логинов В.А.), как дополнительного средства: при синдроме кишечной недостаточности (Левченко С.А.), Н.pylori- ассоциированном гастрите (Грищенко Е.Б.) и других.

Штаммы Bacillus subtilis используются в ряде лекарств и продуктов для ветеринарии и сельского хозяйства. В частности, пробиотик «Субтилис» (жидкая форма «Субтилис-Ж» и порошок «Субтилис-С»), включающий в свой состав собой микробную массу живых спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis применяется в животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве для профилактики и лечение заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, дисбактериоза, легочных инфекций, увеличения продуктивности, получения здорового потомства, подавления роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов (

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Гатауллин Айрат Гафуанович. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07 Москва, 2005 131 с. РГБ ОД, 61:05-3/1040

Введение

Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний 9

Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм 18

2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus 18

2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus 26

2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями 32

2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34

Глава 3. Объекты и методы исследований 41

3.1. Объекты исследований 41

3.2. Методы исследований 43

3.2.1. Оборудование и методики 45

Глава 4. Характеристика выделенных штаммов 53

4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов 53

4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro 55

4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis 57

Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм 62

5.1. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo 62

5.2. Изучение влияние штамма B.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе 70

Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата 76

6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах 76

6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении 84

Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков . 94

Заключение 98

Выводы 107

Список литературы 108

Введение к работе

Актуальность проблемы

V На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые

данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .

* Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Нако-

- пленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики

бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней

]t среды, а также в организме человека и животных.

I Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая

вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях меди-

"4 цины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарствен-

ных средств США, присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием

5 для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .

Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .

Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .

На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию жи-

вых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие .

Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов, используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.

Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм.

Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.

Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.

Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.

Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма B.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича под №277 и

Основные положения, выносимые на защиту:

Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

Штамм В.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.

По технологическим характеристикам штамм В.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.

9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний

Макроорганизм и его микрофлора являются единой экологической системой, которая начинает формироваться с момента рождения и находится в состоянии динамического равновесия, являясь естественным защитным механизмом от патологических воздействий. Представляя открытый биоценоз, микрофлора желудочно-кишечного тракта включает множество локальных микробиоценозов, занимающих тот или иной биотоп в организме человека или животного. Биотопы пищеварительного тракта располагаются в вертикальном (проксимодистальном) и горизонтальном направлениях. Помимо просвета, микрофлора кишечника в горизонтальном направлении может локализоваться в двух отделах слизистой оболочки: в слое гликопротеинов слизи, гликокаликсе, состоящем из гликопротеинов и гликолипидов над мембранами эпителиальных клеток .

Нормальную микрофлору здоровых людей и животных принято подразделять на индигеннную или резидентную, характерную для данного вида, и транзиторную. В пищеварительном тракте обнаружено около 500 видов микроорганизмов. Более 97% общего количества бактерий кишечника включает бесспоровые анаэробы - Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus, Eubacterium, содержание которых достигает Ю"^КОЕна 1 грамм фекалий. Число факультативных анаэробных микроорганизмов (Escherichia coli, Enterococcus spp., Staphylococcus spp. и др.) в сотни раз ниже .

Одной из важных сторон защитной функции бактерий нормальной микрофлоры является антагонистическая активность в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря биохимической активности представителей микроэкологической системы пищеварительного тракта, обеспечивающих продукцию субстанций с выраженной антагонистической активностью, попадающие извне патогенные микроорганизмы быстро элиминируют-

10 ся из кишечника. Это предотвращает развитие инфекционного процесса .

* Бактериальный антагонизм может осуществляться благодаря клеточному

контакту, в результате которого антибактериальные агенты передаются от штаммов-ингибиторов к штамму-мишени. В некоторых случаях колонизационная резистентность реализуется за счет сочетания антагонистического действия определенных представителей нормальной микрофлоры и (или) их метаболитов, а также появления специфических антител .

Fuller R. и Ленцнер А.А. с соав. доказали роль лактобацилл в поддержании микробного баланса благодаря продукции молочной кислоты и специфической адгезии к эпителию толстой кишки. Показана их антагонистическая активность в отношении патогенных бактерий, в частности, Salmonella typhimurium.

Бифидобактерии, продуцируя уксусную и молочную кислоты, препятствуют размножению гнилостной и патогенной микрофлоры, нормализуют пери-

^ стальтику, а также способствуют всасыванию кальция, железа, витамина D и

участвуют в процессах витаминообразования .

Vollaard E.J. et al. отметили, что кишечная палочка влияет на развитие и статус местной иммунной системы, связанной со слизистой оболочкой и обеспечивают защиту хозяина от инфекций, обусловленных энтеропатогенны-ми микроорганизмами. Она принимает участие в расщеплении белков и углеводов, метаболических превращениях холестерина, желчных кислот, жирных кислот .

У E.coli также обладают канцеролитическими свойствами. Карапетян А.О.

J выделила из кишечника здоровых лиц штаммы кишечной палочки и фекально-

го энтерококка, которые in vitro обладали способностью вызывать некроз рако-вых клеток. В то же время бактерии, выделенные от онкологических больных,

t таковыми свойствами не обладали. Этот микроб синтезирует в кишечнике 8 ви-

таминов: В] 5 В 2 , В 6 , В12, К, никотиновую и пантотеновую кислоты, биотин. Кроме того, E.coli создает необходимую анаэробную среду для строгих анаэро-

бов, поглощая Ог, диффундирующий из кровеносной системы через кишечную стенку в просвет. Наблюдения за естественной микробной колонизацией кишечника новорожденных и эксперименты по имплантации микробов в кишечник гнотобиологических животных обнаружили, что анаэробные бактерии обычно начинают колонизацию только после таких бактерий, как E.coli .

Важными регуляторами роста бактерий в кишечнике являются различные БАВ, экзоэнзимы и бактериоцины, например колицины, микроцины, лизоцим и др. Большинство авторов считают, что бактериоцины отличаются от "классических" антибиотиков более узким спектром антибактериального действия, поскольку специфически подавляют рост бактерий того же или филогенетически родственных видов. Например, патогенные энтеробактерии подавляют нормальную микрофлору и беспрепятственно распространяются в кишечнике. Возможно, колицины у представителей кишечной палочки, подавляя рост микроорганизмов, играют роль факторов естественной устойчивости макроорганизма .

Следует отметить, что колонизационная резистентность обеспечивается как представителями преобладающей анаэробной микрофлоры, так и факультативно аэробными бактериями, значение которых в 70-х годах прошлого века стало искусственно занижаться. Защитные свойства E.coli обусловлены не только антагонизмом на метаболическом уровне (бифидобактерии, бактероиды лактобациллы), но и могут быть опосредованными через макроорганизм . Однако интимная связь E.coli с ним, обеспечивающая "созревание" эпителия слизистой оболочки кишечника и формирование так называемого естественного иммунитета, вызывает и более "агрессивное" поведение микроба .

Нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнаталь-ном развитии макроорганизма .

Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают иммуно-

стимуляцию и иммуносупрессию, а также важные адъювантные и иммуноген-ные свойства. Известно, что бактериальные липополисахариды (ЛПС) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А - иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .

Таким образом, микрофлору пищеварительного тракта следует рассматривать как единую микроэкологическую систему, сформировавшуюся в ходе эволюции, которая выполняет и регулирует многочисленные функции организма хозяина, поддерживая колонизационную резистентность и тем самым, сохраняя его гомеостаз .

Французскими исследователями опровергнуто сложившееся мнение об индифферентности транзиторной части нормальной микрофлоры, как в отношении других бактерий, так и макроорганизма. Некоторые штаммы транзиторных эшерихий и бифидобактерий значительно снижали продукцию токсина С.difficile в кишечном тракте животных-гнотобионтов. Bacillus cereus - аэробный спорообразующий микроорганизм, выделенный из почвы, был использован как представитель транзиторной микрофлоры в препарате "Цереобиоген" (КНР) для лечения диарейных заболеваний у детей. Продолжительность его пребывания в кишечнике - 4 дня, но за это время он способствует размножению бифидофлоры и почти полному исчезновению клинических симптомов заболевания. Индийские ученые нашли, что микробы с транзиторным статусом, а не только представители резидентной микрофлоры, способны вырабатывать витамины и детоксицировать токсические продукты. Ими выделены виды рода Bacillus из тонкого отдела кишечника крыс, способные разрушать нейротокси-ны, гемагглютинины, присутствующие в бобах. Представители родов Bacillus и Klebsiella синтезируют витамины Вь В 2 , В^, никотиновую и фолиевую кислоты .

Различные заболевания инфекционной и неинфекционной природы, а также многие другие неблагоприятные факторы (изменение климатических ус-

13 ловий, лучевые воздействия, погрешности в режиме питания, ухудшение общего физиологического статуса, соматические расстройства, применение лекарственных средств, возрастные изменения организма и др.), действуя прямо или опосредованно, оказывают отрицательное влияние на сложную микроэкологическую систему макроорганизма в пользу активации условно патогенной микрофлоры .

Дисбиоз - это любое количественное или качественное изменение типичного для данного биотопа состава нормальной микрофлоры человека или животного, возникающее в результате воздействия различных факторов экзогенного и эндогенного характера, которое влечет за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма, либо являющееся следствием патологических процессов, развивающихся в нем. Факторы, ведущие к нарушениям микрофлоры, т.е. к дисбиозам, весьма многочисленны. Видимо поэтому почти 90% населения нашей страны, в той или иной мере, страдает дисбиозами. Они, как правило, сопряжены с нарушениями иммунной системы. Очевидно, изменения нормофлоры, состояние иммунного статуса и проявление болезни следует рассматривать в единстве, причем роль пускового механизма в каждом конкретном случае может принадлежать любому из этих компонентов триады. В одних случаях дисбиоз дает толчок развитию патологического процесса непосредственно, в других случаях он возникает через развитие иммунодефицита, в третьих - вызывает эти взаимосвязанные процессы .

Однако в последнее время дисбиоз кишечника все чаще считают следствием возникших иммунологических нарушений .

Клинические проявления дисбиозов многообразны: диспептические расстройства (запоры, диарея), нарушения обмена веществ, катаральновоспали-тельные заболевания (гастриты, дуодениты), гнойно-воспалительные заболевания и осложнения разной локализации, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гепатиты, злокачественные новообразования, аллергия и т.д. .

Попытки применения только антимикробных препаратов для профилактики и терапии дисбиозов оказались малоэффективными, и в некоторых случаях усугубляли начавшийся процесс. Это определяет целесообразность применения средств корригирующей терапии, включающей препараты пробиотики, биодобавки, фитопрепараты для восстановления эубиоза .

С тех пор как было открыто свойство различных микробных культур, подавлять рост других микроорганизмов и особенно патогенных, виднейшие естествоиспытатели работали над проблемой практического использования явления антагонизма микробов (Л.Пастер, И.И.Мечников, Н.Ф.Гамалея и др.). Мысль о целесообразности регулирования состава кишечной микрофлоры при ее нарушениях, высказанная еще И.И.Мечниковым, привела к развитию нового направления в медицине - бактериальной терапии, созданию биологических препаратов-пробиотиков из живых бактерий, представителей нормальной микрофлоры человека .

Термин «пробиотики» предложен в 1974 г. Паркером для обозначения организмов и субстанций, обеспечивающих равновесие кишечной микрофлоры. Для отбора штаммов микроорганизмов в качестве препаратов - пробиотиков предложено несколько критериев: апатогенность, специфическое окрашивание по Граму, резистентность к кислотам и окислителям, колонизация и (или) адгезия к клеткам пищеварительного тракта, выделение противоколиформных факторов, резистентность к желчи, жизнеспособность и стабильность .

Пробиотики используют для коррекции микроэкологических нарушений при острых и хронических заболеваниях и дисфункциях желудочно-кишечного тракта, при нарушениях обмена, после антибактериальной, гормональной и лучевой терапии, в предоперационный и послеоперационный периоды, при неблагоприятных условиях и т.д. . Их биотерапевтический эффект может быть связан с прямым антагонистическим действием на патогенные и условно патогенные микробы, приводя к уменьшению их количества, с влиянием на их метаболизм, или же со стимуляцией иммунитета .

Препараты - пробиотики, изготавливают из живых антагонистически активных бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека: кишечной палочки (колибактерин), бифидобактерий (бифидумбактерин, бифидумбактерин форте, бифилиз), смеси кишечной палочки и бифидобактерий (бификол), лактобактерий (лактобактерин, ацилакт, аципол). В последние годы для лечения дисбиозов в лечебную практику были внедрены отечественные препараты, изготовленные на основе живых апатогенных антагонистически активных представителей рода Bacillus: споробактерин, бактис-порин, биоспорин .

При приеме per os, микроорганизмы, составляющие основу пробиотиков, большинство из которых являются к тому же представителями нормофлоры ЖКТ, заселяют его, способствуя нормализации биоценоза и, как следствие этого, восстановлению пищеварительной, обменной и защитной функций. Аналогичный механизм действия проявляется и при других способах аппликации (например, вагинальном) .

При приеме пробиотиков, как правило, не развиваются побочные реакции, и они не имеют противопоказаний к применению.

Большинство пробиотиков (бифидумбактерин, лактобактерин, аципол, ацилакт, бифилиз) могут быть применены уже с первых дней жизни, в том числе, и для недоношенных детей .

В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитывают, главным образом, следующие показатели: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению биомассы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Важен также спектр их антибиоти-корезистентности .

Особое внимание уделяется критериям безопасности используемых штаммов для здоровья человека .

По совокупности физиолого-биохимических свойств и факторов биологической активности наиболее перспективными для создания пробиотиков из

неиндигенной микрофлоры оказались бациллы, главным образом, относящиеся к B.subtilis, B.pumilus, B.polymyxa. Эти виды, стабильно выделяющиеся из разнообразных биотопов, в том числе, из организма и тканей теплокровных, насекомых и растений, не вызывали у последних патологических изменений.

Особенный интерес представляет вопрос о биологических свойствах споровых бактерий, изолируемых из организма человека или животных, с точки зрения познания механизмов их воздействия на макроорганизм. Кроме того, эта проблема важна для выявления новых резервов создания эффективных лечебно-профилактических препаратов, поскольку почти половина выделенных бацилл проявляет антагонистические свойства по отношению к различным патогенным и условно патогенным бактериям и грибам, при этом наибольшую активность проявляют штаммы Bacillus subtilis .

Установлена их способность синтезировать низкомолекулярные полипептидные антибиотики .

В качестве антагониста микобактерий туберкулеза предложен штамм B.subtilis МЖ-6, который в 96,2% случаев подавлял их рост in vitro. .

Обнаружено, что бактерии рода Bacillus способны оказывать антагонистическое воздействие по отношению к бактериям различных видов Klebsiella (336 культур) . Различные штаммы В. subtilis подавляли рост 57-83% культур К. ozaenae, 50-100% культур К. rhinoscleromatis, 64-95% - К. pneumoniae. Практически все тестируемые штаммы бактерий рода Klebsiella оказались чувствительны к тем или иным культурам В. subtilis, при этом значительное количество клебсиелл были одновременно чувствительны к действию нескольких культур сенной палочки.

При изучении антагонистической активности 150 свежевыделенных штаммов В. subtilis относительно К. rhinos cleromatis в опытах in vivo и in vitro, выявлен антагонизм у 114 культур по отношению к 5 тест - штаммам K.rhinoscleromatis. Из числа исследованных штаммов бацилл наибольшую активность проявляли культуры, выделенные из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных .

17 Исходя из выявленных уникальных биологических свойств бактерий рода Bacillus, в последние десятилетия внимание исследователей привлекают проблемы создания препаратов на основе живых спорообразующих аэробных бактерий и изучения их влияния на макроорганизм.

Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus

На современном этапе можно считать установленным, что лечебный эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в том числе способностью продуцировать бактериоцины, подавляющие рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов, высокоактивные ферменты (протеазы, рибонуклеазы, трансаминазы и другие), а также субстанции, нейтрализующие бактериальные токсины. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма .

Изучение механизма лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организм человека и животных показало, что бациллы способны проникать из желудочно-кишечного тракта в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохраняя жизнеспособность. После перорального приема, уже в первые минуты через слизистые ротоглотки, пищевода и желудка примерно 0,1% от общего числа бактерий проникали в паренхиматозные органы. Бессимптомная транслокация микроорганизмов наблюдалась 6-8 часов после однократного приема препарата, чем определяло время воздействия препарата на макроорганизм. По данным двумерного электрофореза, в течение 0-10 мин после прорастания спор штамм В. subtilis 168 синтезировал 65 экзобелков, на 10-20 минуте -210 белков, а всего в ходе вегетативного роста клеток продуцировал 260 белков .

Существует предположение, что явление транслокации микроорганизмов в органы и ткани здоровых индивидуумов представляет собой эволюционно сформировавшийся динамический процесс, во многом определяющий участие общей нормальной микрофлоры в формировании защитных реакций макроорганизма .

В результате транслокации бацилл в кровь и органы теплокровных не происходит каких-либо патологических изменений. Этот процесс следует рас 27 сматривать в качестве одного из начальных звеньев естественного механизма стимулирования неспецифической резистентности в отношении всех микроорганизмов. При этом не исключаются возможные неблагоприятные последствия для макроорганизма в тех случаях, когда происходит проникновение патогенных микроорганизмов на фоне общего или локального ослабления защитных механизмов.

В свете понятия об экзогенном компоненте нормальной микрофлоры (поступающей с пищей, воздухом, водой) и связанной с ней транслокацией бацилл в органы и кровь, подтверждается целесообразность именно перорального введения пробиотиков, разработанных на основе экзогенных представителей микрофлоры. .

Антагонистическое действие бацилл осуществляется за счет продукции различных по природе биологически активных веществ: полипептидных антибиотиков, лизоцима, литических ферментов .

Высокая ферментативная активность бацилл имеет положительное значение с точки зрения обогащения желудочного секрета дополнительными, в том числе, парадигестативными ферментами. Показано, например, что культуры, входящие в состав Биоспорина или Бактерина-SL, проявляли выраженную пек-толитическую активность (0,1-0,2 ед/мл), обладали целлюлозолитическими свойствами, синтезировали комплекс протеолитических ферментов. Общая протеолитическая активность соответствовала 4,2-5,7 ед/мл, активность амилазы составляла 11-15 ед/мл, липазы - 70-127 мкмоль, олеиновой кислоты - 5-10 ед/мл . Культуральная жидкость штамма В. subtilis содержала следующие ферментативные активности: 1,3-1,4 глюканазу, 1,3-1,4 глюкозидазу, .

На модели пиелонефрита у мышей показано, что применение Биоспорина способствовало более быстрой элиминации S. aureus из почек, по сравнению с контрольными животными, за счет стимуляции макрофагов. Полученные данные позволили предположить, что биопрепараты из бацилл перспективны не только для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, но, возможно, и для лечения бактериальных инфекций, локализованных вне желудочно-кишечного тракта .

Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов

Для аккумуляции перитонеальных нейтрофилов животным внутрибрю шинно вводили 2 мл 1% раствора казеина; через 4-5 часов мышей забивали транслокацией шейных позвонков, используя премедикацию эфиром согласно правилам гуманного обращения с животными. Перитонеальную жидкость получали, промывая брюшную полость раствором Хенкса с гепарином во избежании агрегации нейтрофилов. Из полученной от 5 мышей перитонеальной жидкости одной группы животных формировали клеточный пул. Морфологическое изучение показало, что 70-85% клеточного содержимого составляли нейтрофи-лы. Жизнеспособность клеток превышала 95%. Клеточный пул центрифугировали при 1500 об/мин в течении 10 мин. Затем добавляли 300 мкл сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 3% уксусной кислоты, подсчитывали в камере Горяева количество выделенных нейтрофилов.

Методика постановки теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) спонтанного и стимулированного in vitro. Метод основан, на спо собности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать его в гранулы синего цвета нерастворимого диформазана (ДФ). Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций "метаболического взрыва", сопровождающих процесс фагоцитоза, а также повышением метаболизма активированного нейтрофила. Различают спонтанный и индуцированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста ука зывают на количество активированных клеток в образцах. Результаты стимули г рованного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов А к активации in vitro. Постановку реакции проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований. При анализе спонтанной активности в лунку вносили: 50 мкл 0,4% раствора НСТ, 50 мкл инкубационной среды (ИС-0,85% раствор NaCl с 20% содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота), и 100 мкл клеточной суспензии. Для анализа индуцированной активно 50 сти в каждую лунку вносили: 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл взвеси стимулятора (опсонизированный (о/з) и неопсонизированный (н/з) зимозан в соотношении 20 частиц/клетку) и 100 мкл клеточной суспензии. Каждый вариант реакции проводили в 2-х параллельных пробах. Контроль реагентов осуществляли заменой клеточной суспензии эквивалентным объемом ИС. Планшет инкубировали 20 мин при 37С. Для остановки реакции восстановления НСТ и осаждения клеток, содержащих ДФ, планшет центрифугировали 10 мин при 500g. Осажденные в лунках клетки фиксировали 96 % этиловым спиртом и однократно отмывали 0,85 % раствором NaCl. Разрушение клеток и растворение образовавшегося ДФ достигали добавлением в каждую лунку по 130 мкл ди-мексида и 70 мкл 2М КОН с последующей инкубацей - 20 мин при 60С. Содержимое лунок приобретало бирюзовое окрашивание, интенсивность которого зависила от количества экстрагированного ДФ. Результаты реакции регистрировали на спектрофотометре по разнице экстинкций на тестовой (630 нм) и референтной (490 нм) длин волн.

Оценку получаемых результатов проводили по уровням спонтанной активности нейтрофилов (сНСТ), индуцированной о/з активности нейтрофилов (о/зНСТ), индуцированной н/з активности нейтрофилов (н/зНСТ). Результаты тестов выражали в mOD (от англ. - Optical Density). Резервы функциональной активности клеток оценивали по коэффициентам активации (КАо и КАн), степень дискретности клеточной активности на различные стимулы определяли по коэффициенту опсо-низации (КО). (п=5).

Анализ хемилюминесценции фагоцитов выявляет образование клетками активных кислородных радикалов, включая супероксидный анион, синглетный кислород и гидроксильный радикал, участие в определенной степени миелопе-роксидазы фагоцитов, которая является показателем интенсивности дыхания клеток при фагоцитозе .

Ход анализа: В каждый флакон для сцинтилляционного счета добавляли 200 мкл lxlO 6 люминола, а затем вносили 200 мкл суспензии нейтрофилов, чтобы их конечная концентрация составила 0,5хЮ6на1 мл. Перемешивали со 51 держимое флаконов, помещали их в счетчик и проводили измерение хемилю-минесценции при 37 С в 0,1 минутные интервалы на протяжении 90-120 минут. Обычно через 45-60 минут после начала измерения заканчивалась адгезия клеток на стекло, интенсивность хемилюминесценции приближалась к исходному уровню. В этот период в те же флаконы вносили суспензию зимозана (оп-сонизированного и неопсонизированного) по 20 мкл (исходная суспензия 20 мг/мл после размораживания разводилась в10 раз, и это разведение вносили во флакон). Далее снова измеряли хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Затем делали пересчет импульсов на 1 клетку и выражали хемилюминесценцию условно в имп/мин/клетка. (п=5).

Плазмидный анализ ДНК. Исходя из задач данного исследования, осуществляли стандартную процедуру, предназначенную для очистки плазмиднои ДНК с использованием щелочного лизиса . Биомассу (2 мл) суспендировали в 2 мл раствора следующего состава: 50 мМ глюкозы, 20 мМ Tris-HCl; 10 мМ EDTA; рН 8,0. К ней добавляли 20 мкл лизоцима (8 мг/мл), перемешивали и инкубировали при +4 -+8С 20 минут. После этого добавляли 4 мл лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1% SDS), перемешивали и продолжали инкубировать при той же температуре 5 минут. По истечении времени добавляли 3 мл нейтрализующего раствора (З М ацетат калия, рН 4,8), аккуратно перемешивали и инкубировали 30 минут при +4 - +8С. Далее пробирку центрифугировали (Backman J2-21, ротор JA-14) 30 минут при +4С со скоростью 10000 об/мин. Супернатант отбирали в пробирки и добавляли к нему 2,5 объема этанола. Инкубировали при температуре -70 С 10-15 минут и центрифугировали в течение 20 минут при температуре +4С (Backman J2-21, ротор JA-20) со скоростью 10000 об/мин. Осадок растворяли в 600 мкл воды, переносили в микроцентрифужные пробирки, добавляли 400 мкл 7,5 М Na-ацетата и инкубировали при -20 С в течение 30 минут. Затем центрифугировали 10 минут со скоростью 18000g при +4С. Осадок промывали 70% этанолом и затем высушивали на воздухе. Полученный препарат растворяли в 400 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) и подвергали фенол-хлороформной экстракции . Добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ (1:1), насыщенной буферным раствором Tris-HCl, рН 8,0. Смесь интенсивно встряхивали на вортексе и центрифугировали 6 минут со скоростью 13000g при комнатной температуре. Су-пернатант переносили в чистые пробирки и добавляли равный объем смеси хлороформ/изоамиловый спирт (25:1). Пробирку встряхивали на вортексе и центрифугировали при 16000g и температуре +4 С в течении 2 минут. Супернатант переносили в чистые пробирки и осаждали ДНК из раствора добавлением 2,5 объема этанола и 1/10 объема ЗМ раствора ацетата натрия. Пробирку инкубировали при температуре -70 С 10-15 минут и затем центрифугировали 10 минут при 16000g и температуре +4 С. Супернатант удаляли и промывали осадок 70% спиртом (добавляя и сливая 200-500 мкл). Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 200 мкл водного раствора рибонуклеазы А с концентрацией 5-10 мкг в мл и инкубировали 40 минут в термостате при температуре +37 С. Повторяли процедуру осаждения ДНК с помощью этанола и ацетата натрия. Осадок ДНК растворяли в 200 мкл ТЕ-буфера.

Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo

Промышленное получение препаратов на основе живых апатогенных микроорганизмов напрямую связано с подбором и оптимизацией питательной среды для выращивания.

Оптимальный выбор ингредиентов в среде способствует максимальному накоплению биомассы и проявлению антагонистических свойств штаммов, что служит показателем высокой продуктивности процесса культивирования .

Однако пробиотические штаммы имеют трофические особенности. Их следует учитывать в системе "штамм - питательная среда". Получение эффективных пробиотиков на основе штаммов В. subtilis остается актуальной задачей, для решения которой может быть использован принцип адекватности рецептуры питательной среды свойствам штамма. При изучении этого вопроса культивирование осуществляли на средах известного состава и разработанных нами средах на основе гидролизата соевой муки (СПАС-2, СПАС-4, СПАС-6) или на пептоне (ВК-2).

При оценке ростовых свойств сред на основе гидролизата соевой муки с пептоном (СПАС-2, СПАС-4, СПАС-6) и среде с пептоном (ВК-2) сравнение показателей культивирования проводили по отношению к средам, применяемым для выращивания штаммов В. subtilis - продуцентов БАВ (среды: № 5, № 9, КГ - картофельно-глицериновая).

Поскольку физиологические свойства культуры могли измениться в зависимости от добавления различных источников углеводов, целесообразно было сравнить результаты культивирования В. subtilis 1719 на средах исходного состава и с добавлением в качестве источника углеводов: глюкозы, мальтозы, сахарозы и лактозы.

Сравнение уровня оптической плотности (ОП) и скорости роста (и) кле-ток в культуральной жидкости в течение 18 ч выращивания на средах без Сахаров (рис. 6.1.) показало, что среды №5, СПАС-6 и картофельно-глицериновая среда обеспечивали рост штамма с показателем ОП, равным 0,24±0,01 (и=0,03 ч"1), 0,22±0,01 (1)=0,0334-1) и 0,3±0,01 (и=0,025 ч 1) соответственно. На средах СПАС-2, СПАС-4, №9 максимальная величина ОП составляла 0,42+0,03 (и=0,067 ч"1), 0,38±0,02 (1)=0,0541) и 0,58±0,03 (1)=0,037 ч"1) соответственно, а на среде ВК-2 - 0,85+0,6 (\ =0,068ч"). Время достижения максимальной концентрации биомассы на этих средах варьировало в пределах от 9±0,7 ч (СПАС-2) до18±1,Зч(КГГ).

Максимальный выход биомассы (ОП) выявлен на среде ВК-2, при скорости роста 0,068 ч"1, а наименьший на среде СПАС-6 и скорости роста 0,033 ч"1. Добавление к средам в качестве источника углеводов глюкозы (рис. 6.2.) вызывало подъем концентрации клеток В. subtilis 1719 почти вдвое, кроме сред №5, №9 и СПАС-6: на среде №9 отмечено недостоверное снижение значения ОП до 0,43±0,03 при практически той же скорости роста (0,035 ч"1), а на СПАС-6 величина ОП оставалась на прежнем уровне. Наиболее высокий выход биомассы выявлен на среде ВК-2, при этом ОП составила 1,0±0,09 (при 1)=0,066 ч"1) к 18 ч роста. Мальтоза (рис. 6.3.) оказалась оптимальным углеводом в составе сред №9 и №5. Величина ОП увеличилась на среде №9 до 0,695±0,025 (і)=0,058 ч"1) к 12 ч, а на среде №5 - 0,51±0,045 (и=0,022 ч"1) к 18 ч. На средах СПАС-4 и КГ выход биомассы снизился по сравнению с использованием глюкозы с 0,8±0,06 (1)=0,063 ч1) до 0,33±0,01 (1)=0,040 ч1) и с 0,62+0,04 (D=0,03 Ч"1) до 0,38±0,03(и=0,025 ч"1) соответственно. Рост культуры на среде ВК-2 имел тенденцию к снижению выхода биомассы, что отражалось в снижении величины ОП с 1,0±0,09 (1)=0,066 ч1) до 0,55±0,25 (D=0,046 ч"1). Лактоза, добавленная в среды (рис. 6.4.), обеспечивала рост В. subtilis 1719 на уровне ОП от 0,21±0,04 до 0,5±0,03, кроме ВК-2 - 0,83±0,05. Добавление к средам сахарозы (рис. 6.5.) способствовало высокому накоплению биомассы только на среде ВК-2, и ОП достигала значения 1,1+0,06 (и=0,063 ч"1) к 17 ч культивирования. Без дополнительного внесения углеводов оптимальной средой для накопления биомассы оказалась только среда ВК-2. Она обеспечивала наибольшее накопление бактериальных клеток при добавлении глюкозы, лактозы и сахарозы. Максимальный показатель выхода биомассы В. subtilis 1719 получен на среде ВК-2 с добавлением глюкозы (ОП - 1,0±0,09) к 18+0,15 ч культивирования или сахарозы (ОП - 1,1+0,06) к 17+1,0 ч культивирования. Установлено, что состав питательных сред не оказывал какого-либо влияния на антагонистические свойства штамма.

Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении

Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .

Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности, у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах. Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид. Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью. Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.

В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.

Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: про 101 дуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.

Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью. Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .

В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.

В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.

Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы В.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам, т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .

Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .

Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.

Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .

К числу микробов, весьма широко распространенных в природе, относится и эта бактерия. Палочка сенная была описана в 1835-м. Данное название микроорганизм получил от того, что его первоначально выделили из перепрелого сена. В лаборатории в запечатанной емкости сено отваривали в жидкости, затем настаивали суток двое или трое. После этого образовывалась колония Так началось подробное исследование этой распространенной бактерии.

Изучение

В науке есть такой термин - «модельный организм». Когда представители природы отбираются для интенсивного изучения процессов, свойств, для проведения научных экспериментов. Яркий пример - инфузория-туфелька, которая хорошо знакома нам по урокам биологии.

Палочка сенная - также модельный организм. Благодаря ей досконально изучено образование спор у бацилл. Она является моделью понимания механизма жгутиков у бактерий, сыграла свою роль в исследованиях молекулярной генетики.

Ученые проводили эксперименты по культивированию Bacillus Subtilis в близких к невесомости условиях, изучая изменение популяционных геномов. А еще данные микроорганизмы используются в исследованиях влияния ультрафиолетового излучения космоса, адаптивных способностей к нему организмов живой природы. На примере сенной палочки изучают возможность жизни бактерий в условиях иных планет Солнечной системы (сегодня все большее внимание уделяют Марсу).

Краткие характеристики

Бактерии сенной палочки имеют прямую и вытянутую форму, тупые закругленные окончания, обычно бесцветные. Диаметр в среднем - 0,6 мкм, а длина колеблется - 3-8 мкм. При данных параметрах сенную палочку под микроскопом отлично можно рассмотреть и даже сфотографировать, используя современные технологии. Бацилла подвижна благодаря своим жгутикам. Они вырастают по поверхности клетки, и это можно разглядеть на снимках.

Среда обитания

Сенную палочку традиционно относят к Она попадает затем и на листы растений, на фрукты, овощи. При этом она встречается в пыли воздуха, в водной среде. И даже является сегментом микрофлоры кишечника и у животных, и у человека. Развивается при температурах от +5 до +45 градусов Цельсия (оптимально - в районе 30).

Сенная палочка. Размножение

Как и другие бактерии, размножается простым делением клетки (продольным). Новые организмы, образовавшиеся в результате такого деления пополам, частенько остаются соединенными меж собою нитью. Такие соединения легко различимы на фотоснимках.

Bacillus subtilis относят к спорообразующим микроорганизмам. Это позволяет выжить в случае наступления неблагоприятных условий для жизнедеятельности. Спорообразование бацилл начинается так: содержимое клетки приобретает структуру зернистости. Какое-то из зерен, чаще в центральной части, начинает расти, покрываться твердой оболочкой. Вместе с тем происходит разрушение оболочки исходной клетки. Процесс в финале завершается вытягиванием во внешнюю среду характерной споры. Любая из клеток после деления сохраняет свою способность в образовании спор, большинство из которых имеют округлые или же овальные формы. Они довольно устойчивы к внешним факторам и повышению температуры - к примеру, выдерживают нагрев свыше 100 градусов по Цельсию. Характерно, что бактерия, развившаяся из споры, неподвижна, а способности к перемещению появляются только у последующих поколений микроорганизма.

Как питается сенная палочка

Данную бактерию относят к сапрофитам, она питается погибшей органикой. Являясь гетеротрофом, сенная палочка не может синтезировать из неорганики вещества, необходимые для своего питания. Потому использует органику, которая была произведена другими организмами. Из нее она добывает необходимый для энергообмена углерод.

В питании основным источником служат полисахариды происхождения растительного (крахмал) и животного (гликоген). В процессе производятся аминокислоты, витамины, различные ферменты и антибиотики при помощи синтеза.

Взаимодействие с другими микроорганизмами

Данная бацилла способна подавлять развитие условно-болезнетворных и патогенных микробов: сальмонеллы и стрептококка, стафилококка и прочих «вредителей». Например, многими поколениями хищников выработан рефлекс употребления определенных видов растений. И этот способ не только дает организму витамины, но способствует тому, что туда попадают споры Bacillus Subtilis, которая может уничтожать патогенные разновидности микрофлоры, повышая вместе с тем и иммунитет.

А еще эта бацилла может служить питанием для простейших. К примеру, начало пищевой цепочки может выглядеть так: сенная палочка - инфузория-туфелька - определенный вид моллюска - рыба - человек.

Патогенность

По различным классификациям эта бацилла не является патогенной и для людей, и для животных. Она участвует в процессе переваривания пищи, расщепляет белки с углеводами, борется с патогенами кишечника, кожных покровов млекопитающих. Исследователи установили, что в числе бактерий, которые оказываются, к примеру, в ранах людей, всегда присутствует сенная палочка. Она вырабатывает ферменты, которые разрушают отмершие ткани, а также антибиотики, которые угнетают патогенную микрофлору, оказывают легкое воздействие как антиаллергическое лекарство. Доказано наукой: эта бактерия подавляет и развитие возбудителей инфекций при хирургических вмешательствах.

Но, впрочем, отмечают и негативное действие данной бациллы: может вызвать аллергию, выражающуюся в сыпи по телу; иногда вызывает пищевое отравление после употребления продуктов питания, испорченных жизнедеятельностью этого микроорганизма; может стать причиной тяжелой глазной инфекции человека.

Диссертация

Гатауллин, Айрат Гафуанович

Ученая cтепень:

Кандидат биологических наук

Место защиты диссертации:

Код cпециальности ВАК:

Специальность:

Микробиология

Количество cтраниц:

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний

Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм

2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus

2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus

2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями

2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований 43 3.2.1. Оборудование и методики

Глава 4. Характеристика выделенных штаммов

4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов

4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro

4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis

Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм

5.1. Изучение токсичности, токсигенности , вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo

5.2. Изучение влияние штамма В.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе

Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата

6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах

6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении

Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков"

Актуальность проблемы

На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих

Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Накопленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней среды, а также в организме человека и животных.

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам , послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США , присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .

Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .

Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования

На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию живых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил , споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген , энтерогермин и другие .

Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов , используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.

Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм .

2. Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.

3. Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.

4. Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.

5. Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма В.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид , антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.

3. По технологическим характеристикам штамм B.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме "Микробиология", Гатауллин, Айрат Гафуанович

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как B.subtilis. В препаратах ДНК штаммов B.subtilis плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль антибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма B.subtilis 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма B.subtilis 1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы .

4. Установлено, что штамм B.subtilis 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахаро-зо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором NaCl - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный , бесплазмидный, нетоксичный штамм B.subtilis 1719, обладающий пробиотической и иммуно-модулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. J1.A. Тарасевича.

6. Штамм B.subtilis 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытия и достижения современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику новые биопрепараты - пробиотики. Основу этих лекарственных средств составляют живые микробные культуры. В основе лечебного действия этих препаратов лежит выраженный микробный антагонизм в отношении патогенных и условно патогенных штаммов - возбудителей болезней. В процессе лечения не менее важной является иммуномодулирующая активность пробиотиков. Неоспоримые преимущества препаратов из живых бактерий перед лекарствами, синтезированными химическим путем, это - безвредность, их физиологич-ность для организма человека, отсутствие аллергических реакций,. Уже сейчас пробиотики заняли лидирующие позиции при коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушениях обмена веществ, лечении последствий антибактериальной, химио-, гормональной и лучевой терапии. В ре зультате исследования феномена транслокации бактерий показано, что пробиотики могут с успехом заменять антибиотики и протеолитические ферменты при профилактике и лечении различных хирургических инфекций.

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам , послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабиль> ны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Высокая активность у штаммов против одного набора тест - культур не гарантирует его активности против других. В связи с этим использование спорового пробиотика ограничено конкретными лечебными целями. Вариабельность нозологических форм гнойно-септических заболеваний и многообразие этиологически значимых для развития дисбиотических нарушений микроорганизмов определяют требования к используемому биопрепарату. Это побуждает исследователей к постоянному скринингу штаммов-антагонистов с заданными свойствами.

Изученные нами штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами, типичными для представителей В. subtilis, и характеризовались набором ферментов , расщепляющих различные субстраты.

По данным литературы B.subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов и высокой ферментативной активностью, за счет чего нормализуют процессы пищеварения, а также обеспечивают антитоксический и противоаллергический эффект .

Исследованные штаммы B.subtilis имели широкий спектр антагонистической активности, низкий (В. subtilis № 1719) или средний (В. subtilis № 1594, В. subtilis № 1318) уровень адгезии.

Таким образом, изученные нами штаммы характеризовались высокой пробиотической активностью. Однако изучение биохимических свойств показало, что штамм B.subtilis 1719 обладал более высокой ферментативной активностью (протеазной , амилазной, липазной), что выражалось в наибольшей зоне гидролиза исследуемых субстратов . Кроме того, низкий уровень адгезивной активности штамма В.subtilis 1719 и, по-видимому, его природная антибиотикоустойчивость , контролируемая хромосомой, позволили сделать заключение о перспективности дальнейшего изучения этой культуры.

На наш взгляд, перспективы для расширения промышленного выпуска препаратов на основе рода Bacillus очень велики.

Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .

Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности , у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах . Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид . Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью . Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.

В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.

Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов , подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз , рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.

Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью.

Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .

В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.

В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.

Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы B.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам , т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .

Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .

Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.

Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .

Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают им-муностимуляцию и иммуносупрессию. Установлено, что бактериальные ли-пополисахариды (ЛПС ) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А -иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .

Какой бы высокой антимикробной активностью не обладало лекарственное средство, решающая роль в ликвидации инфекционного патологиче ному статусу. Создание препаратов, эффективных по антимикробным показателям и стимулирующих реакции иммунитета, представляется важной задачей. Поэтому большое количество исследований направлено на изучение влияния препаратов - пробиотиков на разные звенья иммунной системы человека и животных.

Введение живых культур аэробных бацилл заметно стимулирует in vivo продукцию сывороточного интерферона и интерферона, индуцированного in vitro вирусом болезни Ньюкастла .

В ряде работ указывается на то, что препараты - пробиотики оказывают иммуномодулирующее действие, восстанавливая нарушенный патологией иммунный статус, увеличивая продукцию эндогенного интерферона, усиливая функциональную активность макрофагальных клеток, повышая фагоцитарную активность лейкоцитов крови - моноцитов и нейтрофилов .

Нашими исследованиями показано, что культура В. subtilis 1719 достоверно изменяла метаболическую активность нейтрофилов при коррекции дисбиоза и не вызывала изменений функциональной активности нейтрофилов при нормальном состоянии индигенной микрофлоры. Кроме того, установлено, что дисбиоз сопровождался повышением уровня ФНО-а, что свидетельствовало о выраженной фагоцитарной, цитотоксической, адгезивной активности макрофагов, лимфоцитов, а также клеток эндотелия и эпителия тонкой кишки.

Повышенная секреция провоспалительного цитокина у мышей с дис-биозом, вероятно, отражает активацию иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов). Под влиянием культуры B.subtilis 1719 * наблюдали снижение продукции ФНО-а. Введение культуры интактным животным, изменений уровня продукции ФНО-а не вызывало.

Учитывая, что ФНО-а является маркером воспалительных реакций, сделан вывод о важной роли пробиотика в повышении противовоспалительной активности иммунокомпетентных клеток у животных.

Проведенные исследования по изучению динамики продукции цитоки-нов под влиянием штамма B.subtilis 1719 показали, что культура не оказывала влияния на продукцию цитокинов в первые часы после введения, кроме IL-lp, количество которого накапливалось постепенно. Уровень других изученных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) значительно возрос в интервале от 12 до 24 ч.

Таким образом, модуляция клеток иммунной системы и изменение потенциала цитокинов может быть одним из механизмов, посредством которого культура В. subtilis 1719 способствует коррекции дисбиоза.

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .

При изучении ростовых свойств культуры В. subtilis 1719 на различных жидких питательных средах, установлено, что для максимального накопления биомассы наиболее адекватным субстратом для культивирования штамма можно считать среду ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы

В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитываются, главным образом, следующие показателя биологической характеристики: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению био* массы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Особое внимание уделяется критериям степени безопасности используемых микроорганизмов для здоровья человека .

В проведенных исследованиях по оценке жизнеспособности микробных клеток B.subtilis 1719 при хранении в присутствии жидких стабилизаторов выявлено, что оптимальным стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволял сохранять жизнеспособность и антагонистические свойства штамма в течение 2 лет. Для сохранения свойств культуры в течение 1,5 лет возможно использование 10% раствора глицерина, 1 года - дистиллированной воды, при этом установлено, что указанные наполнители, статистически значимых влияний на антагонистические свойства штамма B.subtilis 1719 не оказывали. Необходимо отметить, что важным фактом является способность штамма B.subtilis 1719 сохранять антагонистическую активность в отношении S.sonnei и S.aureus в жидких стабилизаторах длительный срок -36 мес. (срок наблюдения).

Лиофильное высушивание с сахарозо-желатиновым стабилизатором сохраняло жизнеспособность и антагонистическую активность штамма B.subtilis 1719 в течение 4 лет (срок наблюдения).

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил , споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген , энтерогермин и другие

Сравнительное изучение штамма B.subtilis 1719 по антагонистической и адгезивной активности с коммерческими культурами следующих пробиоти-ческих препаратов: Споробактерин, Россия (В. subtilis 534), Цереобиоген, Китай {В.cereus DM423), Субтил, Вьетнам {В.cereus var. vietnami), Бактисубтил, Франция (B.cereus IP5832), Нутролин, Индия (B.coagulans), показало, что выделенный штамм является оригинальным и может быть рекомендован в качестве производственного, при получении нового препарата-пробиотика.

Таким образом, по физиолого-биохимическим свойствам штамм B.subtilis 1719 имеет четко различимые индивидуальные признаки, занесенные в паспорт культуры при депонировании в коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Кроме того, доминирующее положение выделенного штамма B.subtilis 1719 по антагонистической активности свидетельствует о перспективности использования этой культуры для разработки на его основе пробиотического препарата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гатауллин, Айрат Гафуанович, 2005 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медизд, 1962, 180 с

2. Байбаков В.И., Карих Т.Л., Борукаева Л.А. и др. Нормализация кишечной микрофлоры и общего состояния мышей линии JCR под влиянием концентрата бифидобактерий.//Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, №3. - С. 20-24.

3. Байда Г.Е., Бударина Ж.И. Первичная структура и анализ гена гемолизина II Bacillus cereus // 2 Откр. гор. науч. конф. мол. Ученых г. Пущино , 23-25 апр. 1997: Тез. докл. Пущино. - 1997 - С. 45-46.

4. Байда Г.Е., Кузьмин Н.П. Ген HLY-III Bacillus cereus, клонированный в Escherichia coli, кодирует новый поро-формирующий гемолизин // Междун. конф. посвящ. памяти акад. А.А.Баева: Тезисы докл., Москва, 20-22 мая 1996. М. - 1996. - С. 108, 291.

5. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечни-ка//СПб. «Питер ». -2000. -209 с.

6. Баханова Е.М., Николаев С.М., Николаева И.Г., и др. Раст. ресурсы. 2001 . Т. 37, вып. 1. С. 70-76. Влияние экстракта из побегов Pentaphylloides fruticosa на течение экспериментальных дисбактериозов кишечника, вызванных сульфадиметоксином и изониазидом

7. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ильичев А.А. Перспективы конструирования иммунопрепаратов на основе рекомбинантных бацилл // Новые направления биотехнологий: Тез. док. YI Конф. РФ, 24-26 мая, 1994. Пущино. -1994.-С. 68.

8. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробио-тики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всеросссийской научно-практической конф. М. - 1996. - С. 7.

9. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М., и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата пробиотика Субалина. Журн. микробиол ., 2003, №2, с. 102-109.

10. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Респ. сборник научных трудов: «Аутофлора человека в норме и патологии. Горький. - 1988. - С. 74-78.

11. Билибин А. Ф. //Тер. арх. -1967. № 11. - С. 21-28.

12. Билибин А. Ф. // Клин. Медицина. 1970. - № 2. - С. 7-12.

13. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Медицина, 1982. - С. 180.

14. Блинкова Л.П., Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // ЖМЭИ. 1994. -N5.-С. 71-72.

15. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вьюницкая В.А. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella / Микробиол. ж. 1989. - Т. 51, N 1. - С. 87-91.

16. Бойко Н.В., Лисецька М.В. Розробка пробютиюв виб1рковощн: Протискле-ромна ефектившсть деяких штам1в В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 194-198.

17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН . -М.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клин, гастроэн-терол. 2004. № 3. С. 83-87.

19. Бочкарева Н.Г., Белогорцев Ю.А., Удалова Э.В. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент комплекса гидролитических ферментов , обогащенных b-глюканазой // Пат. N 2046141 Россия, С12 N 9/42, Опубл. 20.10.95. - Бюл. N 29.

20. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл //Автореф. дис. канд. мед. наук. Тарту. -1990. - 25 с.

21. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Адгезивные и ге-магглютинирующие свойства лактобацилл . Журн. микробиол., 1982, 9: 7578.

22. Васильева В.Л., Тацкая В.Н., Резник С.Р. Опыт применения растительного и микробного адъювантов при получении иммунных асцитных жидкостей у лабораторных животных // Мжробюл. журн. 1974. Т. 36, N 3. - С. 358-360.

23. Вершигора A.E. Основы иммунологии // Киев: Вища школа. 1975. - 319 с.

24. Винник Ю.С., Перьянова О.П., Якимов С.В. и др., Метод лечения гнойных ран с использованием антагонистов / International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 4., С. 143.

25. Виноградов Е.Я., Шичкина В.П. Штамм бактерии В. mucilaginosus в качестве продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета у телят // А.с. 1210452, СССР -1/00. Опубл. 27.04.96. - Бюл. N 12.

26. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.Итоги науки и техники: Биофизика 1989; 24: 172.

27. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбакте-риозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН . -1997. - № 3. -С.3-9.

28. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Зуденкова А.Е., Буданова Е.В. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в экспериментах на мышах . Журн. микробиол., 2001, 1: 62-67.

29. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника человека. Журн. микробиол., 2003, 1: 6063.

30. Вьюницкая В.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Некоторые механизмы действия новых микробиотиков // Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Сборник тезисов Алма-Ата, 1990. - С. 17.

31. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий // М.: Медицина. 1968. - 115 с.

32. Гончарова Г.И., Семенова А.П., Лянная A.M., и др. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике и его коррелятивная связь с состоянием здоровья человека.// Антибиотики и микроэкология человека и животных. -1988.-С.118—123

33. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.//Диссертация в форме научного

34. Грачева Н.М., Гончарова Г.И. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника. Методические рекомендации. 1986, С. 23

35. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А. и др. - Новые лекарственные препараты. 1994, №1, С. 3-12

36. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И. и др. Эффективность нового бактерийного препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. 1996. - N 1. - С. 75-77.

37. Гребнева A.J1., Мягкова Л.П. Кишечный дисбактериоз//Руководство по гастроэнтерологии в 3 т. М., 1996. -Т.З. -С.324-334

38. Григорьева Т.М., Кузнецова Н.И., Шагов Е.М. Штамм Bacillus thuringiensis 4КН, синтезирующий экзотоксин со специфической активностью против колорадского жука// Биотехнология. 1994. - N 9-10. - С. 7-10.

39. Гулько М.А., Казаринова JI.A., Позднякова Т.М. Способ получения инозина // Пат. N 175583, С12Р 19/32. Опубл. 30.08.94. - Бюл. N 16.

40. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике. Журнал Цитоки-ны и воспаление, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35

41. Егоров Н.С., Зарубина А.П., Выборных С.Н., Ландау Н.С. Синтетическая * среда для выращивания бактерий рода Bacillus // Вестник МГУ . 1989. N 4.1. С. 52.

42. Ермакова Л.М., Смирнова Т.А., Алиханян С.И. и др., Кристаллические включения у мутанта Bacillus subtilis с измененным спектром протеиназ // Докл. АН СССР. 1977. - Т. 236, N 4. - С. 1001-1003.

43. Жирков И.Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят// Ветеринария. 1999. N 4. - С. 40-42.

44. Згонник В.В., Фуртат И.М., Василевская И.А. и др. Антагонистические свойства спорообразующих бактерий, контаминирующих процесс производства лизина//Микробиол. ж. 1993. -Т.55, N4. - С. 53-58.

45. Зинкин В.Ю. Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата. Автореф. дис. канд. мед. наук.- Москва, 2004.

46. Зуденков А.Е. Микрофлора и состав иммунокомпетентных клеток пристеночного муцина толстой кишки в норме и при некоторых патологических состояниях. Автореф. дис. канд. мед. наук,- Москва, 2001.

47. Ивановский А.А., Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария. 1996 - N11. - С. 34-35.

48. Ивановский А.А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. Бюл. N 20.

49. Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Итоги и перспективы применения бактокулицида // Совр. достиж. биотехнол.: Матер. 1 Конф. Сев.-Кавк. региона, Ставрополь, сент. 1995. Ставрополь. - 1995. - С. 14-15.

50. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры.//Русский медицинский журнал. 2000. - Т. 8, №13-14. - С. 572-575.

51. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., 2000.

52. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережнизкая Т.Г. и др. Бактерии рода 4 Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней.// Мшробюл. ж. - 1995.- Т.57, N 5. - С. 69-78.

53. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М., 1979. -198 с.

54. Кудрявцев В.А.,Сафронова JI.A., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Мик-робиол. ж. 1996 - Т.58, N 2. - С. 46-53.

55. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-С. 11-14.

56. Лапчинская А.В., Шендеров Б.А. Коррекция дисбактериозов, вызванных цефалексином, некоторыми иммуномодуляторами.//Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. -С.70—79

57. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.Т., Микельсаар М.Э. с соавт. Лактофлора и колонизационная резистентность.//Антибиотики и мед. биотехнология. -1987. -32. -№3. -С. 173-180.

58. Лещенко В.М. Клиника, диагностика и лечение висцерального кандидамикоза . Методические рекомендации. М., 19871.

59. Лисецька М.В. Експериментальне визначення антагонютичжм активносп штам1в Bacillus subtilis щодо Klebsiella rhinoscleromatis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 207-212

60. Лопатина Т.К. с соавт. Иммуномодулирующее действие препаратов* эубиотиков //Вестник РАМН. М., «Медицина ». -1997. №3. -С.30-34

61. Лукин А.А. Антибиотикообразование и споруляция у плазмидных и бес-плазмидных микроорганизмов // Пущино. 1978. - С. 25-28.

62. Мазанкова JI.H., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. и др. Бактиспорин новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей// Человек и лекарство: Тез. докл. V Российского Национального Конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997г. - М. - С. 199.

63. Мазанкова Л.Н., Ваулина О.В. Новые лекарственные средства для коррекции дисбиотических нарушений.//Детский доктор. 2000. №3. - С. 51-53.

64. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, 1984.

65. Марков И.И., Жданов И.П., Марков А.И. Штамм Bacillus subtilis МЖ-6 антагонист микобактерий туберкулеза // Пат. N 2120992, С 12N 1/20. - Опубл. 27.10.98.-Бюл.N30.

68. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А. и др., Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis II Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. Саратов. -1998.-7 с.

69. Митрохин С.Д. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - № 8. - С.46 - 50.

70. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автореферат дис. д-ра мед. наук, М., 1998. 37 с.

71. Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушкин Е.В., Иваников И.О. и др. - М., 1997. 45 с. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбакте-риоза (дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней (Методические рекомендации).

72. Митрохин С.Д., Шендеров Б.А.Микробиологические и биохимические показатели изменения микробной экологии толстой кишки крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики и химиотерапия - 1999, Т. 34 № 6 (482-4).

73. Молчанов O.JL, Позняк A.JI. Применение биоспорина в комплексной терапии бактериального вагиноза // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. С. 187.

74. Музыченко JI.A., Сенаторова В.Н., Альховская JI.JI. и др. Морфометрический анализ развития микроорганизмов / Биотехнология. 1990. - N 3. - С. 3-6.

75. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения// М.:Б.и..- 1977.- С.343 347

76. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения вос-«. палительных процессов и аллергических заболеваний // Международная заявка. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989.

77. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии // Наука в СССР. - 1991. - N 4. -С. 116-121.

78. Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения молочного продукта, предназначенного для лечения диатеза, дисбак-териоза и бактериальных инфекций // А.с. N 1648975, S.U. публ 15.05. 91.

79. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных // А.с. N 1723117, S.U. публ. 12. 1992.

80. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения противовоспалительных процессов и аллергических заболеваний // А.с. N 1723116, S.U. опубл. 12. 1992.

81. Никитенко Л.И., Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus sp. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии // А.с. N 1710575, S.U. - публ. 5. 1992.

82. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всерос. научно-практ. конф. -М.- 1996.-С. 26.

83. Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Голинкевич Е.К., Комкова Е.Е. Изменение биоценоза пищеварительного тракта поросят при включении в рацион Bacillus micilaginosis // Бюл. ВНИИ физиол., биохимии и питания с-х животных. 1989.-N 2. - С. 31-35.

84. Обухова О.В., Соболева Н.Н. О наличии фактора распространения в культурах сапрофитных споровых бактерий // Журн. микробиол. 1950. - N 12. С. 482-485.

85. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1980-04, 2004.

86. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Влияние кислотности среды и температуры на рост и экскрецию полисахаридов Bacillus subtilis при глубинном культивировании // Мисробюл. журн. 1998. - Т. 60., N 4. - С. 25-32.

87. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибак-терина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля.// Автореф. дис.канд.биол.наук.- М., 1997.- 25 с.

88. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева JI.B. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых про-биотиков // Журн. микробиол. 1998. - N 6. - С. 68-70.

89. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Г., Васильева Е.А., Гайде-ров А.А. Споровые пробиотики. Журн. микробиол. - 2003. №3. с. 113-119.

90. Остерман Л.Д. Методы Исследования белков и нуклеиновых кислот. 1981.

91. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. и др. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят/ Ветеринария, 1996. - N 3. - С. 17.

92. Панчишина М.В., Олейник С.Ф. Дисбактериоз кишечника. Киев, 1983

93. Паршина С.Н., Имшенецкий А.А., Нестерова Н.Г. и др. Штамм бактерий Bacillus сегеш"-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием // А. с. N 1615177, С 12N 1/20. Опубл. 23.12.90. - Бюл. N 4. 1988.

94. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир, 1978, 332 с

95. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений о эндо-экологии человека // Рус. ж. Вич/Спид и родст. пробл. 1997.- Т. 1, N 1. С. 161-162.

96. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.:Медицина. -1976. -217 С.

97. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Новый комплексный эубиотик «биоспорин » для детей и взрослых / Здравоохранение Башкортостана. 1998. -N 1. - С. 97-99.

98. Погосян Г.П., Надирова А.Б., Калиев А.Б., Карабаев М.К. Плазмида pCLl и антимикробная активность штамма Bacillus sp. 62 II Молекулярная генетика, микробиол. и вирусология. 1999. - N 1. - С. 37-38.

99. Подберезный В.В., Париков В.А. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis - продуцента пробиоти-ка// RU Патент № 2100029, опубл. 27.12.97. Бюл.№36.

100. Подберезный В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке // Ветеринария.- 1996.-N 1.-С. 21-29.

101. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колониза-ционнной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность/Груды ВНИИ антибиотиков.- М. -1990. -вып.Х1Х. -С. 15-25.

102. Полховский В.А., Буланов П.А. О декарбоксилазах аминокислот у Bacillus cereus //Микробиология. 1968. - Т. 37, N 4. - С. 600-604.

103. Поспелова В. В., Грачева Н.М., Антонова Л. В. и др. Биологические микробные препараты, их лекарственные формы и сферы применения //Новые лекарственные препараты: Экспресс информация. -1990. -Вып. 5. - С. 1-8.

104. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. и др. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека.//Иммунобиол. препараты. М. -1989. -С. 142-152.

105. Резник С.Р. Способ лечения и профилактики вирусных и бактериальных заболеваний животных // SU, А.с. N 1311243, опубл. 1982.

106. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт // Патент N 2035186. RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

107. Резник С.Р., Шуст И.И. Гематологические и цитохимические показатели телят при даче препарата Бактерии- SL // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. -Киев, 1989. С. 25.

108. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузным методом. Современные методы клинической микробиологии, выпуск 1. Смоленск, 2003.

109. Ряпис JI.A., Липницкий А.В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1998. - N 6. С. 109-112.

110. Савицкая К.И. Нарушения микроэкологии желудочно-кишечного тракта и хронические болезни кишечника // Terra medica. - 1998. N 2. - С. 13-15.

111. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. и др., Опыт использования бактиспорина в комплексном лечении детей с термической травмой // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. - С. 268.

112. Синев М.А., Бударина Ж.И., Гавриленко И.В. и др., Доказательство существования гемолизина II Bacillus cereus: клонирование генетической детерминанты гемолизина II // Молек. биол . 1993. - Т. 27, N 6. - С. 1218-1229.

113. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл , перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. 1990. - N2. - С. 9-14.

114. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1982 - 280 с.

115. Смирнов В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных // Киев, 1983. -49 с.

116. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ// Киев. Нау-кова думка.- 1983.- 278 с.

117. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактеремии // Микробиол. журн. 1988 -Т. 50,N6.-С. 56-59.

118. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Способ лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний суспензией живых культур // А. с. N 1398868 S.U. - А 61 К 35/74. - публ. 30.05.88, бюл. N 20.

119. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А. с. N 1722502. S.U. - А 61 К. 39/02, публ. 30.03.92.

120. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92.

121. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода BacillusII Микробиол. журн.- 1993.- 55,- № 4.С.92—112

122. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 38-44.

123. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин // Патент N 2035185, RU. А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

124. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней // Патент N 2129432. -А. 61 К 35/74. - Бюл. N 12, опубл. 27.04.99.

125. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая В.А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков // Мшробюлопчний журн. 1995. -Т. 64, N 5. -С. 661-667.

126. Смирнов В.В., Косюк И.В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus-компонентов дробиотика // Мшробюлопчний журн. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 36-43.

127. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. -1996. Т.41, N 10. - С. 13-15.

128. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств био-спорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл // Мшробю-лопчний журнал. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 43-49.

129. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т. 43, N 2. - С. 20-23.

130. Сторожук П.Г., Быков И.М., Сторожук А.П. Патогенетическая направленность белкового питания и заместительной ферментотерапии при имму-нодефицитных состояниях организма // International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 10., С. 110-115.

131. Таболин В.А., Бельмер С.В., Гасилина Т.В. и др. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей. Методические рекомендации. М., 1998. -11с.

132. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: Автореф. дис. канд. биол. наук. Минск, 1997. -21 с.

133. Тришина Н.В. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета. Автореф. дис. канд. мед. наук. -Москва, 2003., 24 с.

134. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М 1978; 175.).

135. Фазылова А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста // Авт. кан. дис. Уфа. - 1998. - 24 с.

136. Харвуд К. Бациллы . Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52.

137. Харченко С.Н., Резник С.Р., Литвин В.П. Способ борьбы с плесневением кормов // А.с. N 751382, СССР., опубл. в Б.И., 1980, N 28.

138. Хмель И.А., Чернин Л.С., Леванова Н.Б. и др. Штамм бактерий Bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов // Патенты 1817875 Россия F01N 63/00, C12N 1/20. опубл. 20.05.95. - Бюл. N 14.

139. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите // Микробиол.ж. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 63-67.

140. Чхаидзе И.Г., В.Г. Лиходед, и др. Корректирующее действие антител при экспериментальном дисбактериозе // Журн. Микробиол. 1998, №4: 12-14.

141. Шарп Р., Скавен М., Аткинсон Т. Бациллы: Генетика и биотехнология. -М. 1992. - 398 с.

142. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса//Вопр.питан. -1999. -Т.68. -№2. -С.32

143. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. I, С. 287.

144. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и химиотерапевтиче-ские и антибактериальные препараты.// Антибиотики и колонизационная резистентность: Труды ВНИИ антибиотиков. М. -1990. -вып.Х1Х. -С.5-16.

145. Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, N 7. - С.30-34.

146. Шендеров Б.А.Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. II, С. 413

147. Ямпольская Т.А., Великжанина Г.А., Жданова Н.И. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент L-фенилаланина: А.с. N 1693056, С 12 Р 13/22, опубл. 23.11.91. Бюл. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Piglets fed froom birthwith the probi-otic Bacillus coagulans as additive: Zootechnical and microbiological aspects // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvant activity of bacterial glycolipids // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468.

150. Benedettini J. et al. Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st, SieroteMilan. 1983.-V. 62.,N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - p. 63-65.

152. Bernheimer A., Avigad L. Nature and Properties of Cytolytic Agent produced by Bacillus subtilis // J. Gen. Microb.- 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369.

153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. On the industrial use of Bacillus licheni-formis: A review // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. A phisiological model for the control of erytromycin production in batch and cyclyc fed batch cuiture // Microbiology. -1997. V. 143, N 2. - P. 475-480.

156. Cipradi G. et al. Effects of an adjunative treatment with Bacillus subtilis for foodallergy // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Effects of pH and aeration on y-poly (glutamic acid) formation by bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures // Biotechnol. and Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17.

159. Devin K.M. The Bacillus subtilis genome project: Aims and progress // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, protein toxic to coleopteran isects // Патент N 5378625 США A61K 31/00. Опубл. 03.01.95.

161. Dubos R. Toxic factors in enzymes used in laundry products // Science. 1971. - N 3993. - P. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Effect of qinolones on intestinal ecology. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Flindt M. Pulmonare disesase due to ingalation of derivates of Bacillus subtilis containing proteolytic enzyme // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181.

164. Fox M. The phylogeny of procaryotes// Science. -1980. V. 209, N 4455. P. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66: 5: 365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Simultaneous production of alpha and beta amylases by Bacillus subtilis Mir-5 in batch and continuous culture // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Alteration of vascular permeability in rabbits by culture filtrates of Bacillus cereus and related species // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brasil. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Biological activites of lipo-teichoic acid and peptidoglycan teichoic acid of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins synthesized during early germination of Bacillus subtilis 168 in the presence of actinomycin D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6.- P. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite //Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, N 3. - P. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin and SF-2370, pharmacologically active agents of microbiol origin // Novel Microbial Prod. Med. and Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson С. E. Lethal toxin of Bacillus cereus 1. Relationships and nature of toxin, hemolysin and phospholipase // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Determination of fatty acid in surfactin and elucidation of the total structure of surfactin // Agric. and Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. Crystal-like structure in the sporulation cells of Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc.- 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. Crystalline inclusions in sporulating Bacillus subtilis cells // In: Spores YI. Select. Pap. 6th Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H., Nomura M., Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74: 7: 2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Пат. N 5364738. США. МКИ A01N 25//00. - публ. 15.11.94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkaline serine proteinase and lectine isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis // Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1994.-V. 41,N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occur-ing plasmids //Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Thin-layer chromatographic technique for rapid detection of bacterial phospholipases // J. Clin. Microbiol.- 1975. V.2, N 5. - P. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Continuos production of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plasmid DNA in bacilli // In: Microbiology- Washington. 1976. - P. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Influence of detergent on aerosol allergic sensitization with enzymes of Вас. subtilis // Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1976. -V. 51, N 5. - P. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Exclusion of intestinal pahogens by continuous feeding with Bacillus subtilis C-3102 and its influence on the in testinal microflora in broilers // Anim. Sci. and Technol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: A relational database for the Bacillus subtilis genome // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Importance of spore mutants for fed-batch and continuous fermentation of Bacillus subtilis // Biotechnol. and Bioeng. 1995. -V. 47, N 6. - P. 696-702.

192. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist are active ayanist nematodes / Патент N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, заявл. 27.07.90., опубл. 29.09.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Allergic reactions of the lungs to enzymes of Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. The human gastric bactericidal barrier: Mechanisms of action, relative antibacterial activity, and dietary influences.//J. Infec. Diseases. -1989. -159 № 5. -p.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biochemistry biological activities of the proteina-ceous crystal of Bacillus thuringiensis // J. Sci. and Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632.

196. Rocchietta I. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosental G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l"etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - C. 97-104.

199. Salminen Seppo Clinical aspects of probiotics //Ecol. health and Disease.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Lung disfuction in worcers exposed to Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Characterization of the phospholipases of Вас. cereus and their effects on erytrocytes, bone and kidnei cells // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis // In: Sem. etude theme Prod, natur. et prot. plant. 1977. - P. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Biological characteristics of an enterotoxin produced by Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Physiological function of natto // J. Brew. Soc. Jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Macoto. Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1 //J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. P. 541-545.

210. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: mechanism and clinical consequences.//Nahrung. -1987. -31 № 5. -p.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. The contribution of Escherichia coli to microbial colonization resistance.//.!, of Antimicrobial Chemotherapy. -1990.- 26. -p.411-418

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.