Способы постановки реакции преципитации. Реакция преципитации

Реакция преципитации (РП)

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.

Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).

Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3).

Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия:а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.

Реакция иммуноэлектрофореза (ИЭФ)

В основе реакции лежит принцип преципитации. ИЭФ, как правило, используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Реакцию проводят в два этапа. Вначале проводят электрофоретическое разделение антигена в забуференном агаровом геле. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. После этого в канавку, которая расположена по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются дугообразные линии преципитации. С помощью ИЭФ анализируются состав и количество белков сыворотки крови, спиномозговой жидкости, микробных протеинов (рис. 4).

/ 34
ХудшийЛучший

В основе реакций преципитации лежит образование и выпадение в осадок комплексов антиген-антитело. В реакции участвуют растворимые антигены: преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде (в агаре или геле).

Реакция преципитации в жидкой среде (кольцепреципитация). Реакцию ставят в узких пробирках, куда вносят преципитирующую антисыворотку, а сверху осторожно наслаивают прозрачный раствор антигена. При положительной реакции через несколько минут на границе соприкосновения двух жидкостей появится кольцо преципитации. При малых количествах реагентов реакцию можно проводить в капиллярах (микропреципитация).

Реакция преципитации в агаре. Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки в агаре, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони. Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по Манчини, которая используется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (см. иммуноглобулины).

Реакции преципитации используются для; определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике.

§ 3. Окраска по Граму (в модификации Синева) производят следующим образом. Из исследуемого материала готовят тонкий препарат-мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют на пламени спиртовки.

§ 4. Окраска зерен волютина по Нейссеру.

§ 5. Окраска капсул по методу Бурри-Гинса.

§ 3. Метод микроскопии в темном поле.

3Анятие 5

§ 9. Сделать посев отпечатков пальцев руки на пластинки мпа и среды Эндо.

§ 4. Результаты посева на среды пестрого ряда зарегистрировать в таблице.

§ 5. Приготовить взвесь почвы в Физиологическом растворе. С помощью пастеровской пипетки засеять 1-2 капли взвеси на среду Тароцци.

§ 4. А) Определение дифтерийного экзотоксина реакцией преципитации в агаре.

§ 7. Демонстрация различных методов заражения экспериментальных животных:

§ I. Макроскопическое изучение культур стафилококков на кровяном мпа. Зарисовать картину гемолиза.

§ 2. Демонстрация инструментария, посуды, разбор правил пе­ресылки материала для исследования в бактериологические лаборато­рии.

§ 5. Опыт действия лизоцима на Micrococcus lysodeikticus.

§ I. Определение ld50 по методу Рида и Менча. Ld50 - ко­личество микроорганизмов (бактерий, вирусов), вызывающих гибель 50 % зараженных животных.

§ 3. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:

§ 4. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:

§ 5. Реакция агглютинации:

§ I. Разбор методов приготовления 0- и н-антигенов.

§ 5. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:

§ I. Учесть окончательный результат реакции агглютинации и определить титр испытуемой агглютинирующей сыворотки. Результаты опыта отметить в таблице, схема которой дана ниже.

§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

§ 6.Реакция преципитации в агаре.

§2. Реакция лизиса.

§ 4. Реакция фагоцитоза. Постановка опсоно-фагоцитарной реакции.

§5. А)Прямой иммунофлуоресцентный метод.

§ I. А). Опыт трансдукции.

Часть II. Вирусология

§ I. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

§ 2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Графа. Сущность этого метода состоит в следующем.

§ 3. А). Элементарные тельца (вирионы) вируса оспы (тельца Пашена) в препаратах, окрашенных по Морозову, выглядят в виде мелких точек круглой или удлиненной формы, темно-коричневого цвета.

§ 4. Методы заражения животных разнообразны: внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, интраназальный, заражение в мозг и другие.

§ 6. С помощью камеры Горяева подсчитают количество клеток в 1 мл. Клетки считают по всей камере под малым увеличением микроскопа. Количество клеток в 1 мл вычисляют по формуле:

3. Методы микробиологической диагностики вирусных заболеваний

3Анятие 3

1. Вирусологические:

2. Эпидемиологические:

§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:

Часть III

§1.Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на на­личие заболевания бруцеллезом у данного больного?

§ 2,3. Поставить реакцию агглютинации с монорецепторными 0- и н-сыворотками, принимая во внимание биохимические свойства выделенной культуры. Результаты зарегистрировать в тетрадь.

§ 1. Произвести макро- и микроскопическое исследование подозрительных колоний (бесцветные, прозрачные). Посеять подозрительную колонию на скошенный мпа и среды "пестрого ряда".

§ 1. Поставить реакцию агглютинации на стекле выделенной культуры кишечной палочки с поливалентными ок-сыворотками:

§1. Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.

§1. Промикроскопировать готовые препараты-мазки из культуры коклюшной палочки с окраской по Граму и зарисовать.

§2. Разбор методов микробиологической диагностики коклюша: бактериологического и серологического. Дифференциация коклюшной и паракоклюшной палочек.

§2. Промикроскопировать готовые препараты-мазки туберкулезных бактерий, окрашенных по Цилю-Нильсену. Препараты зарисовать.

§3. Демонстрация роста туберкулезных бактерий на глицериновом бульоне, яичной среде Петраньяни и других средах.

§7. Ознакомление с составом и назначением следующих иммунопрепаратов: туберкулин Коха, очищенный туберкулин ррd-l, вакцина бжп.

§1. Произвести учет результатов определения биохимической активности коринебактерий и пробы на токсигенность.

§1. Промикроскопировать и зарисовать готовые препараты-мазки риккетсий. По Романовскому-Гимза риккетсии окрашены в красный цвет.

§2. Разбор и демонстрация реакции агглютинации с риккетсиозным антигеном (взвесь убитых формалином риккетсий). Результаты реакции зарегистрировать.

§ 5. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

а)преципитирующую сыворотку;

б)антиген в виде прозрачного раствора (экстракт из микробных тел, из органов или из других патологических субстратов);

в)физиологический раствор;

г)набор специальных преципитационных пробирок.

Порядок работы

В преципитационную пробирку наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки, затем при помощи пастеровской пипетки наслаивают на сыворотку 0,5 мл раствора антигена. Пробирку при этом следует держать в наклонном положении, а после добавления антигена пробирку ставят в штатив (в вертикальном положении). При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется тонкое кольцо помутнения. Степень реакции оценивается по выраженности кольца и времени его появления. Обычно кольцо появляется в течение первых 3-10 минут.

Приготовление бактериального гаптена

Суточная культура бактерий на пластинках МПА в чашках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным раствором углекислого натрия в присутствии индикатора. Полученный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной или разведенной вдвое. На границе между сывороткой и гаптеном появляется кольцо преципитата.

§ 6.Реакция преципитации в агаре.

Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувст­вительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов. Вариант реакции преципитации в агаре для выявления дифтерийного токсина опи­сан в методических указаниях к 7-му занятию.

Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

Результаты реакции агглютинации

Вывод____________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рис.1 Реакция кольцепреципитации (1-опыт; 2-контроль)

Рис.2 Реакция преципитации в агаре

§ 7. В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое рас­пространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.

Первый этап - адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сох­раняются свободными активные центры, и они способны поэтому специ­фически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап - связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против дан­ного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в иссле­дуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н 2 0 2 , используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.

Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицатель­ных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.

Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап - добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному анти­гену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.

Третий этап - после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела про­тив человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Рис.3 Схема использования иммуноферментного и радиоиммунного метода для обнаружения антигенов (А) и антител (Б). Обозначения: 1.Поверхность твердой фазы; 2.Специфические антитела; 3.Антиген (исследуемый материал); 4.Специфические к данному антигену антитела, меченные Ферментом (5) или изотопом (6); 7.Субстрат фермента; 8.Специфический антиген; 9.Исследуемая сыворотка (антитела); 10.Антивидовая сыворотка, содержащая антитела к челове­ческому иммуноглобулину и меченная ферментом (11) или изотопом (12); 13.Субстрат для фермента.

§ 8. Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).

Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. анти­тела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконеч­но in vitro.

Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтези­руемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.

Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.

Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько эта­пов:

1.Получение миеломкой линии.

2.Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.

3.Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.

4.Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.

5.Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.

При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консер­вировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.

В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.

Контрольные вопросы

По каким признакам определяется степень агглютинации в пробирках?

Как производится оценка степени агглютинации?

Для чего необходим контроль в реакции агглютинации?

При какой степени агглютинации реакция считается еще положительной?

Какая агглютинация происходит раньше: 0- или Н-?

Как отличить осадок бактерий от их агглютинации?

В каких случаях происходит спонтанная агглютинация бактерий?

Что такое групповая агглютинация?

Что такое гаптен? Детерминантная группа? Шлеппер?

Какие компоненты участвуют в реакции преципитации?

Какова методика постановки реакции кольцепреципитации?

Для каких целей используется реакция преципитации в агаре?

Какова методика постановки реакции преципитации в агаре?

В чем заключается сущность реакции пассивной гемагглютинации?

Какие компоненты участвуют в реакции коагглютинации и как она ставится?

В чем заключается сущность реакции латекс-агглютинации?

Как ставится реакция агрегат-гемагглютинации и с какой целью она применяется?

На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?

С какой целью используются иммуноферментные методы?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в иссле­дуемой сыворотке?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в иссле­дуемом материале?

Рис.4 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) Эр-эритроцит; Аг-антиген; Ат-антитела к антигену; Эрс-сенсибилизированный эритроцит.

Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?

Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?

Как получают моноклональные антитела?

Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?

Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещивают­ся для получения гибридом?

Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?

ЗАНЯТИЕ 12

Дата_________________

Тема: ИММУНИТЕТ. РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ

План занятия

1.Регистрация результатов реакции агглютинации, поставленной на предыдущем занятии.

2.Реакция лизиса. Гемагглютинация, гемолиз.

3.Реакция связывания комплекса (РСК). Методика постановки РСК. Постановка основного опыта.

4.Реакция фагоцитоза. Определение фагоцитарного числа. Опсонофагоцитарная реакция (ОФР). Определение завершенности фагоцитоза.

5.Иммунофлуоресцентный метод. Получение диагностических люминесцирующих сывороток и их применение:

а)прямой иммунофлуоресцентный метод;

б)непрямой иммунофлуоресцентный метод.

Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии и обработка их люминесцирующей сывороткой.

6.Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для профилакти­ки, лечения и диагностики инфекционных заболеваний (сыворотки, гамма-глобулины, вакцины, анатоксины, токсины, аллергены).

Методические указания

§ I. Учесть результаты реакции, поставленной на предыдущем за­нятии. Обратить внимание на характер агглютинации. Осадок в пробирках в виде плотного с подвернутыми краями слоя, напоминающего пере­вернутый зонтик. При встряхивании жидкости образуется мелкая зерниcтость. Результаты реакции зарегистрировать в таблице, приведенной ниже.

Постановка реакции преципитации в геле.

Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.

Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.

Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.

Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.

Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.

Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.

Линии из преципитата.

Агаровый гель.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.

С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.

Реакции лизиса.

Для этого надо знать:

Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.

3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.

Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Постановка реакции гемолиза .

Для постановки реакции гемолиза необходимы:

3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;

Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);

Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.

Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.

Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.

Реакция преципитации основана на образовании преципитата - осаждении иммунных комплексов антиген-антитело. В растворах они выпадают в осадок, а в гелях откладываются в виде полос. Для определения концентрации антител в исследуемом материале используют очищенные антигены, при этом существует несколько способов проведения реакции преципитации.

Преципитация в растворе

Реакция преципитации в растворах имеет особенность: количество преципитата зависит от количества реагента (антител). Если количество антител меньше количества антигена, то увеличение количества последних приводит к большему образованию преципитата. Наибольшее количество преципитата образуется при относительно равном количестве антигенов и антител. Если антиген находится в избыточном количестве по сравнению с антителами, то при увеличении его концентрации количество преципитата уменьшается.

Иммунодиффузия

Наиболее распространенный способ проведения реакций преципитации связан с иммунодиффузией - способностью антител и антигенов проникать в гель.
Для простой радиальной иммунодиффузии используют гель, в состав которого включены антитела. В тонком слое геля делают круглые прорези и помещают в них исследуемый материал с антигенами, которые проникают вглубь геля, взаимодействуют с антителами и образуют вокруг лунок кольца преципитата. Таким способом определяют содержание иммуноглобулинов в крови.
Многие реагенты для биохимических анализов выпускают зафиксированными на планшетках. В каждой ячейке планшетки содержится строго отмеренное количество реагента, поэтому можно проводить сразу множество анализов с высокой точностью результатов.
При двойной радиальной иммунодиффузии в тонком слое геля на определенном расстоянии друг от друга вырезают два круглых отверстия. В одно помещают реагент, а в другое - исследуемый материал. Антитела и антигены проникают в гель навстречу друг другу. В месте их взаимодействия образуется преципитат.
Для определения концентрации антигена в исследуемом материале измеряют расстояние от лунки с ним до линии преципитата.